目的基因克隆基因工程原理与技术刘志国

1、本节要点本节要点 RT-PCR法法 v RT-PCR的步骤的步骤 v 三种不同引物引导的三种不同引物引导的RT-PCR v 已知基因已知基因N端部分序列端部分序列RT-PCR 其它其它PCRPCR法法 v 反向反向PCRPCR v 锚定锚定PCR PCR v 连接介导的连接介导的PCRPCR v 盒式盒式PCRPCR v RACE RACE 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 一、RT-PCR法 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 1.RT-PCR的步骤骤 反转录反转录 PCR扩扩增 获得获得RNA模板模板 反转录反转录 ：将：将RNA反

2、转反转 录成录成cDNA第一链第一链 常用常用RNA模板模板 常采用常采用异硫氰酸胍异硫氰酸胍-酚酚-氯仿氯仿一一 步抽提法步抽提法 提取的总提取的总RNA中只有少部分是中只有少部分是 mRNA，大部分为，大部分为rRNA和和 tRNA 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 TRIzolTRIzol是一种新型总是一种新型总RNARNA抽抽 提试剂，含有苯酚、异硫氰提试剂，含有苯酚、异硫氰 酸胍等物质酸胍等物质. . 细胞总细胞总RNA 采用亲和层析法采用亲和层析法 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 oligo(dT)oligo(dT)纤维

3、纤维 素柱分离素柱分离纯纯化化真真 核核mRNA mRNA mRN A 基因特异引物（基因特异引物（gene specific primer，GSP） 多聚寡核苷酸引物（多聚寡核苷酸引物（oligo (dT) primer） 随机六核苷酸引物（随机六核苷酸引物（random hexamer primer） 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 三三种种引物引物扩扩增特增特异异性性 高高 低低 反转录反转录 将将RNA反转录成反转录成cDNA第一第一 链链 反转录的引物反转录的引物 ：三种：三种 以合成的以合成的cDNA单链为模板单链为模板，采用，采用基因特异引物基因特

4、异引物 进行常规进行常规PCR扩增扩增 过程：过程： 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 PCR扩增扩增 上游引物与上游引物与cDNA第一链退火，在第一链退火，在DNA 聚合酶的作用下合成聚合酶的作用下合成cDNA第二链第二链 以以cDNA第一链和第二链为模板第一链和第二链为模板 ，用上、下游引物进行，用上、下游引物进行PCR扩增扩增 2. 三种不同引物引导的三种不同引物引导的RT-PCR 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 RNARNA 提取提取 反反 转转 录录 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 PCRP

5、CR 过过程程 3. 已知基因已知基因N端部分序列端部分序列RT-PCR 目的基因的目的基因的DNA序列未知，但其编码蛋白的序列未知，但其编码蛋白的N端部端部 分氨基酸序列已知分氨基酸序列已知 根据氨基酸序列设计的根据氨基酸序列设计的简并引物和简并引物和oligo（dT）进进 行行RT-PCR 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 简并引物简并引物 根据密码子的简并性根据密码子的简并性 设计的针对编码每个设计的针对编码每个 氨基酸的所有碱基组氨基酸的所有碱基组 合的混合物合的混合物 扩增对象扩增对象 扩增方法扩增方法 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法

6、获得目的基因 已知基已知基 因因N N端端 部分序部分序 列列RT-PRT-P CRCR示意示意 图图 获得的目的基因的获得的目的基因的DNA片段不完整，片段不完整，仅知仅知 道基因上一小段序列信息时道基因上一小段序列信息时 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 二、其他PCR法 反向反向PCR 锚定锚定PCR 连接介导的连接介导的PCR 盒式盒式PCR RACE 适用对象适用对象 方法方法 用于扩增已知目的基因序列侧翼的用于扩增已知目的基因序列侧翼的DNA片段片段 1. 反向反向PCR 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 扩增对象扩增对象

7、 操作过程操作过程 酶切酶切 连接环化连接环化 PCR PCR扩增扩增 测序分析测序分析 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 反向反向PCRPCR原原 理示意图理示意图 RS:限制性内内切酶酶切位点 GSP:基因特异异引物 1. 锚定PCR 根据已知序列设计设计的基因特异异引物 2. 锚定锚定PCR 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 扩增对象扩增对象 也称之为也称之为单侧特异引物单侧特异引物PCR（SSP-PCR），）， 是根据已知目的基因的一小段序列信息来快速是根据已知目的基因的一小段序列信息来快速 扩增已知序列上游或下游片段的技术扩

8、增已知序列上游或下游片段的技术 引物引物 引物1 引物2 即即锚定引物锚定引物，根据序列的共同特征设计的，根据序列的共同特征设计的非特非特 异性引物异性引物，非特异性引物所起的作用是在其中，非特异性引物所起的作用是在其中 一端附着。一端附着。与锚定引物结合的序列称为锚定序与锚定引物结合的序列称为锚定序 列。列。 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 方法方法 扩增目的基因已知序扩增目的基因已知序 列列下游下游3端未知序列端未知序列 oligo（dT）作为锚为锚 定引物 扩增目的基因已知序扩增目的基因已知序 列列上游上游5端未知序列端未知序列 用用DNA末端转移酶，末端

9、转移酶， 在在cDNA 3 末端末端加上加上 Poly（dA）尾尾 与此与此Poly（dA）相）相 对应的对应的Poly（dT）作作 为锚定引物为锚定引物 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 PCR具体过程具体过程 包括两轮包括两轮PCR扩扩 增增 第一轮：采用第一轮：采用不对称不对称PCR 高浓度的基因特异引物和低浓度的非特高浓度的基因特异引物和低浓度的非特 异性引物异性引物 第二轮：以稀释后的第二轮：以稀释后的第一轮第一轮PCR产物作产物作 为模板为模板 相同浓度的基因特异引物和非特异性引相同浓度的基因特异引物和非特异性引 物进行扩增物进行扩增 第一节第一节 P

10、CRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 锚定锚定PCRPCR原理示意图原理示意图 在普通在普通PCR过程中增加了连接的步骤，即通过连过程中增加了连接的步骤，即通过连 接反应加上去一个公共接头接反应加上去一个公共接头 3.连接介导的连接介导的PCR 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 应用范围应用范围 只知道只知道DNA一端的序列又要对未知的一端进行测序一端的序列又要对未知的一端进行测序 对体内甲基化图谱或对体内甲基化图谱或DNA印迹进行分析印迹进行分析 方法方法 引物引物 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 通过目的基因的已知序列

11、设通过目的基因的已知序列设 计的计的基因特异引物基因特异引物 引物1 引物2接头引物接头引物 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 连接介连接介 导的导的PCPC R R原理示原理示 意图意图 4. 盒式盒式PCR 方法方法 在普通在普通PCR过程中加入了一个过程中加入了一个 Cassette（盒）（盒） 人工合成的带有限制人工合成的带有限制 性内切酶的粘性末端性内切酶的粘性末端 的双链的双链DNA分子分子 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 Cassette在设计时其在设计时其5末端没有磷酸基团末端没有磷酸基团 目的目的DNA片段的片段的

12、3末端和末端和Cassette的的5末端的末端的 连接部位形成缺口连接部位形成缺口 在第一次在第一次PCR的第一个循环，从的第一个循环，从Cassette引物引物 CP1开始的延伸反应在连接部位终止，开始的延伸反应在连接部位终止，限制了限制了 引物引物 CP1和引物和引物 CP1同一引物之间的扩增同一引物之间的扩增，减，减 少了非特异性少了非特异性PCR扩增扩增 特点特点 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 盒式盒式P P CRCR原原 理示理示 意图意图 CP:CassetteCP:Cassette引

13、物引物 GSP:GSP:基因特异引物基因特异引物 （正义引物）（正义引物） AGSP:AGSP:基因特异引物基因特异引物 （反义引物）（反义引物） 5端之间的未知序列端之间的未知序列 5RACE 5. RACE rapid-amplification of cDNA ends 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 通过反转录和通过反转录和PCR技术进行技术进行cDNA末端快速扩增末端快速扩增， 得到基因转录本的未知序列，从而获得得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完完 整序列的方法整序列的方法 过程和分类过程和分类 以以mRNA为模板反转录成为模板反转录成cDN

14、A第一第一 链链 用用PCR扩增出扩增出 cDNA内某一已知内某一已知 序列位点到其序列位点到其 3端之间间的未知序列 3RACE 锚定锚定PCR被用于被用于RACE技术，根据锚定序列引入技术，根据锚定序列引入 方式的不同，方式的不同，RACE分为分为经典经典RACE和和新新RACE 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 经典经典RACE ：以锚定序列作为引物，以锚定序列作为引物，3RACE 中在反转录时引入第一链中在反转录时引入第一链cDNA，5RACE中中 在合成第二链时引入第二链在合成第二链时引入第二链cDNA 新新RACE ：锚定序列在反转录以前以寡聚核锚定序

15、列在反转录以前以寡聚核 苷酸苷酸RNA的形式连入的形式连入mRNA中中 经典经典3RACE操作步骤操作步骤 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 以以mRNA为模板，用为模板，用反转录引物反转录引物合成合成3端端cDNA第第 一链，在一链，在5端引入了端引入了OP和和IP序列序列 以基因特异引物以基因特异引物GSP1和外侧引物和外侧引物OP进行第一轮进行第一轮 PCR扩增扩增 以第一轮以第一轮PCR扩增的产物为模板，以基因特异扩增的产物为模板，以基因特异 引物引物GSP2和内侧引物和内侧引物IP进行第二轮进行第二轮PCR扩增扩增 PCR产产物进进行直接测测序或克隆于适

16、当载当载体进进行 序列分析 即即锚定引物锚定引物TTT(T)n-TTT(T)n- IP-OPIP-OP，含含oligooligo（dTdT） 序列序列 、外侧引物区、外侧引物区O O P P和内侧引物区和内侧引物区IPIP 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 经典经典3RA CE 原理示原理示 意图意图 TTT(T)n-IP-OP:TTT(T)n-IP-OP:锚定引物锚定引物 IP:IP:内侧引物区内侧引物区 OP:OP:外侧引物区外侧引物区 GSP:GSP:基因特异引物基因特异引物 经典经典5RACE操作步骤操作步骤 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩

17、增法获得目的基因 以基因特异引物以基因特异引物GSP1作为反转录引物产生作为反转录引物产生cDNA 第一链第一链 在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下，在在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下，在cDNA 3 末端加上末端加上Poly（dC）（或（或Poly（dA）尾尾 利用锚定引物（利用锚定引物（5OP-IP-oligo（dG）（或）（或 5OP-IP-oligo（dT ）和基因特异引物和基因特异引物GSP1 进行第一轮进行第一轮PCR扩增扩增 以第一轮以第一轮PCR反应的产物为模板，以基因特异反应的产物为模板，以基因特异 引物引物GSP2和内侧引物和内侧引物IP进行第二轮进行第二轮PCR扩增扩增 第一节

18、第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 经典经典5RACE 原理示意图原理示意图 新型新型5RACE操作步骤操作步骤 CIAP处理总处理总RNA,使使rRNA、 tRNA或或5端不完整端不完整 无帽的无帽的mRNA去磷酸化脱掉去磷酸化脱掉5磷酸基团磷酸基团 TAP处理全长的处理全长的mRNA，去掉其帽子结构，保留，去掉其帽子结构，保留 5端的一个磷酸基团端的一个磷酸基团 设计锚定序列，具设计锚定序列，具OP和和IP区，用区，用T4 RNA连接连接 酶，将具有锚定序列的一段短酶，将具有锚定序列的一段短RNA寡核苷酸寡核苷酸 与去掉帽子结构的与去掉帽子结构的mRNA进行连接进行连

19、接 设计两条引物设计两条引物GSP1和和GSP2，GSP1在在GSP2 的外侧，以第三步中形成的杂合体为模板，的外侧，以第三步中形成的杂合体为模板， 利用引物利用引物GSP1为反转录引物合成为反转录引物合成cDNA第一第一 链链 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 用用GSP1和和OP，GSP2和和IP进行巢式进行巢式PCR 第一节第一节 PCRPCR扩增法获得目的基因扩增法获得目的基因 新型新型5RACE 原理示意图原理示意图 CIAP:CIAP:牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶 TAP:TAP:烟草酸性焦磷酸酶烟草酸性焦磷酸酶 OP:OP:外侧引物区外侧引物区

20、IP:IP:内测引物区内测引物区 GSP:GSP:基因特异引物基因特异引物 第二节 基因的合成 随着技术的发展，用化学的方法人工合成基因成为可能， 人工合成的基因可以是生物体内已经存在的，也可以是按照人 们的愿望和特殊需要重新设计的。 1970年，美国麻省理工学院Khorana 等人首次报道了酵母丙氨酸转移核糖 核酸的全人工合成基因 H.G.Khorana（1922-） 一、DNA人工合成的原理 利用人为操纵的化学反应，使核苷酸间形成正确联接 发展历史：H-亚磷酸酯磷酸二酯法磷酸三酯法 亚磷酸三酯法 固相亚磷酸三酯法：目前最通用的一种合成寡核苷酸的 方法，是在偶联于固相支持物上的连接臂末端通过

21、逐个 加上核苷酸来实现的，其一个合成循环周期分为四个步 骤 去保护(deprotection) 、偶联（coupling）、封端 （capping）、氧化（oxidation） 二、人工合成基因 基因的人工合成是在寡核苷酸化学合成的基础上建立的， 通常的策略是将需要合成的基因分成若干个相互重叠的片段， 先利用化学合成法分别合成这些小片段，然后让这些片段退火 配对，最后利用连接酶和聚合酶将这些片段连接成完整的基因 序列。 DNA小片段全长基因 1、退火-连接法 2、多步退火-延伸-连接法 3、由内向外多步退火-延伸合成法 基因组文库构建基因组文库构建 概述 定义：某种生物基因组的全部遗传信息通过

22、克隆载体 储存于某一受体菌的群体中，这个群体就称为该生物 基因组的文库(genomic library) 目的： a）分离有用的目的基因（可培养细菌未可 培养细菌） b）保存某种生物的全部基因（可培养细菌） 一般流程 一般流程 高分子量环境样品DNA的准备 PFGE分离大片断DNA分子 脉冲场凝胶电泳DNA分子在凝胶中的运动 载体的选择和制备 载体选择 BAC （Bacteial artificial chromosome）vector 细菌人工染色体载体结构 BAC 载体特点 对插入大片断的外源DNA（300 kb）能够复制严谨、 稳定 通过电激发转化大肠杆菌的效率较高 已超螺旋状态存在，分

23、离抽提比YAC容易 克隆中几乎不存在嵌合体(Chimrism) 连接 克隆片段的大小与构建文库克隆子的关系克隆片段的大小与构建文库克隆子的关系 （）（） 文库实际克隆数（N） （）（） 其中p为期望的可能性，f 为片段平均长度与基因组 总长的比值 大片段大片段DNA 是否能有效连接在载体上主要取决于插入是否能有效连接在载体上主要取决于插入 DNA 片段与载体的比例片段与载体的比例, 对于不同生物采用的比例不同对于不同生物采用的比例不同, 大多数大多数BAC 文库采用文库采用1 5 - 15 (摩尔比摩尔比) 目标DNA和载体浓度的确定 转化 制备用于电转化的感受态大肠杆菌细胞 电激转化 对于转

24、化大肠杆菌而言, 电转化是目前使用最普 通的一种手段。电转化效率与插入片段的大小 有关,插入片段越大, 转化效率越低; 反之, 越高 。此外, 转化条件（如温度0-4度）也直接影响 转化效率、插入片段大小及假阳性克隆的含量 。 阳性克隆的挑选阳性克隆的挑选 可通过可通过lacZ 的的- 互补所形成的蓝白菌落筛选互补所形成的蓝白菌落筛选 阳性克隆。阳性克隆。 BAC 文库的鉴定 评价一个BAC 文库质量高低的标准： 假阳性克隆的含量 文库中克隆的数量 插入片段大小 细胞器DNA 的含量 BAC 文库的鉴定文库的鉴定 从文库中随机挑选一定量的BAC 克隆, 提取质粒 DNA , 酶切后, 脉冲电泳

25、检查插入片段的大小 以Southern 杂交来检验BAC 克隆插入片段是否 来源于原材料。检验假阳性克隆, 保证库的质量 BAC 文库的快速筛选文库的快速筛选 高密度膜杂交筛选 Southern 杂交筛选 PCR筛选 基因组文库在环境微生物分子生态中的应用与意义基因组文库在环境微生物分子生态中的应用与意义 环境样品的基因组文库能够代表自然微生物群体中的主要基因信息环境样品的基因组文库能够代表自然微生物群体中的主要基因信息 为原位染色体杂交技术鉴定不可培养细菌提供可靠的信息为原位染色体杂交技术鉴定不可培养细菌提供可靠的信息 增加了对不可培养微生物生理、生化和关键代谢机理的了解增加了对不可培养微生

26、物生理、生化和关键代谢机理的了解 通过基因芯片去探测不可培养微生物的分布、基因表达和对环境的响应通过基因芯片去探测不可培养微生物的分布、基因表达和对环境的响应 海洋环境BAC文库发现了海洋 变形细菌视紫红质的结构模型 Trizol试剂试剂 原理：原理： 优点：快速、简便、容易操作优点：快速、简便、容易操作 氯仿抽提、离心分离水相和有机相氯仿抽提、离心分离水相和有机相 RNA抽提专用试剂，由异硫抽提专用试剂，由异硫 氰酸胍和苯酚组成，可以迅速氰酸胍和苯酚组成，可以迅速 破坏细胞结构，释放出细胞质破坏细胞结构，释放出细胞质 和细胞核中的和细胞核中的RNA 收集水相加入异丙醇，沉淀即为收集水相加入异

27、丙醇，沉淀即为RNA 下一步下一步mRNA的纯化的纯化 紫外分光光度法：紫外分光光度法：OD260=1时，时， 相当于相当于RNA的浓度为的浓度为40g/ml； OD260/OD280 电泳法：电泳法：28S和和18S亮度接近亮度接近2： 1，mRNA分布均匀，则认为分布均匀，则认为RNA 质量较好。质量较好。 cDNA第一链的合成：第一链的合成：mRNA在反转录酶的在反转录酶的 催化作用下得到催化作用下得到cDNA； 常用的反转录酶：常用的反转录酶：AMV、MLV ； 常用引物：常用引物：oligo（dT）、六核苷酸的随机）、六核苷酸的随机 引物引物(dN)6、已知序列引物；、已知序列引物；

28、 Clack-Carbor公式：公式： N=ln（1-p）/ln（1-1/n） 差异克隆技术差异克隆技术 基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制， 高等生物含有数万个不同的基因，但在生物体发育的某高等生物含有数万个不同的基因，但在生物体发育的某 一阶段只有约一阶段只有约10-15%的基因按时空顺序有序地进行表的基因按时空顺序有序地进行表 达，这种表达方式即为基因的差别表达（达，这种表达方式即为基因的差别表达（differential expression）。）。 研究同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶研究同一类细胞在不同生理状态

29、下或在不同生长发育阶 段基因表达的差异的方法很多，有代表性的技术主要有段基因表达的差异的方法很多，有代表性的技术主要有 mRNA差异显示技术（差异显示技术（DDRT-PCR）和抑制性差减杂交）和抑制性差减杂交 （Suppression Subtractive Hybridization，SSH） 技术。技术。 DDRT-PCR技术技术 DDRT-PCR技术的基本原理技术的基本原理 以一对细胞（或组织）的总以一对细胞（或组织）的总RNA反转录而成的反转录而成的cDNA为为 模板，利用模板，利用PCR的高效扩增，通过的高效扩增，通过5端与端与3端引物的合理端引物的合理 设计和组合，将细胞（或组织）

30、中表达的约设计和组合，将细胞（或组织）中表达的约15 000种基因种基因 片段直接显示在片段直接显示在DNA测序胶上，从而找出一对细胞（或组测序胶上，从而找出一对细胞（或组 织）中表达有差异的织）中表达有差异的cDNA片段。对获得表达差异的基因片段。对获得表达差异的基因 片段进行回收、克隆、鉴定及分析。片段进行回收、克隆、鉴定及分析。 DDRT-PCR技术基本流程技术基本流程 3 5 N M A A A A A A A A A AA AAA N M T T T T T T T T T T 3 5 N M A A A A A A A A A AA AAA N M T T T T T T T T

31、T T 逆转录酶 53 锚定引物 PCR 35N M T T T T T T T T T T cDNA第一链 随机引物 差异表达的条带 丰度不同的条带 A细胞B细胞 序列胶电泳 图9-2 DDRT-PCR反应基本程序 DDRT-PCR技术的优点技术的优点 简单，技术上仅仅依靠简单，技术上仅仅依靠PCR和和DNA测序胶电泳；测序胶电泳； 所得到的差别条带往往不只一条，通常包含某一基因的上游及下游所得到的差别条带往往不只一条，通常包含某一基因的上游及下游 的调控基因；的调控基因； 灵敏性高，仅需灵敏性高，仅需0.2g总总RNA作为起始材料，可检出低丰度作为起始材料，可检出低丰度mRNA； 实验周期

32、短，约实验周期短，约8d即可完成，便于重复，而且可重复性好；即可完成，便于重复，而且可重复性好； 最突出的优点是实验过程中可步步验证比较；最突出的优点是实验过程中可步步验证比较； 可进行多基因家族的表达分析，可以同时分析多组样品。可进行多基因家族的表达分析，可以同时分析多组样品。 DDRT-PCR技术的不足技术的不足 假阳性率高，假阳性的比例有时高达假阳性率高，假阳性的比例有时高达5075； 研究表明，差显技术对高丰度研究表明，差显技术对高丰度mRNA具有明显的倾向性；具有明显的倾向性； 由于某些序列的特异性，一些差异表达的转录不能得到分离，所以凝由于某些序列的特异性，一些差异表达的转录不能得

33、到分离，所以凝 胶中的单条带可能由胶中的单条带可能由1种以上种以上cDNA片段所构成；片段所构成； 差异显示所得的差异显示所得的cDNA片段较短，长度多在片段较短，长度多在100 bp500 bp之间，且之间，且 大多位于大多位于mRNA 3端约端约300 bp的非翻译区（的非翻译区（3UTR），很少能扩增到），很少能扩增到 ORF（open reading frame）区和）区和5UTR区；区； 不适合小范围的比较，要达到显示不适合小范围的比较，要达到显示96%以上的以上的mRNA至少需至少需240对引对引 物，要完全显示细胞中所有的物，要完全显示细胞中所有的mRNA种类，据估计需种类，据估

34、计需300种引物对。种引物对。 DDRT-PCR技术的改进技术的改进 对引物体系的改进，目前第对引物体系的改进，目前第3代引物由代引物由GenHunter公司于公司于1996年设计，年设计， 将将 3端端poly（dT）锚定引物和）锚定引物和5端随机引物都带上端随机引物都带上Hind 酶切位点，引酶切位点，引 物条数分别减为物条数分别减为3条和条和8条，而碱基数分别增加至条，而碱基数分别增加至18个和个和13个，这样经计算个，这样经计算 机同源性分析表明所得到的机同源性分析表明所得到的24个组合同样能覆盖所有个组合同样能覆盖所有mRNA，使操作和后，使操作和后 续处理更简便、快捷。续处理更简便

35、、快捷。 其他改进包括：其他改进包括：RT-PCR模板的改进、模板的改进、PCR反应参数的优化、凝胶电泳反应参数的优化、凝胶电泳 及标记方法的改进、杂交方式的改进等。及标记方法的改进、杂交方式的改进等。 SSH技术 SSH技术原理技术原理 SSH是差减杂交与抑制是差减杂交与抑制PCR结合的快速分离差异基因的方法。结合的快速分离差异基因的方法。 运用杂交的二级动力学原理，丰度高的单链运用杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产退火时产 生同源杂交的速度要快于丰度低的单链生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰，从而使得丰 度有差别的单链度有差别的单链cDNA相对含量达到基

36、本一致。而抑制性相对含量达到基本一致。而抑制性 PCR，则是利用非目标序列片段两端的反向重复序列在退火，则是利用非目标序列片段两端的反向重复序列在退火 时产生类似发夹的互补结构，使其无法与引物配对，从而有时产生类似发夹的互补结构，使其无法与引物配对，从而有 选择地抑制了非目的基因序列的扩增，从而使目的基因得到选择地抑制了非目的基因序列的扩增，从而使目的基因得到 富集、分离。富集、分离。 SSH技术操作流程技术操作流程 SSH的优点的优点 假阳性率低：这是它的最大优点，由于假阳性率低：这是它的最大优点，由于SSH方法采用两次消减杂交和方法采用两次消减杂交和 两次两次PCR，保证了该方法具有较高特

37、异性；，保证了该方法具有较高特异性； 高敏感性：在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异高敏感性：在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异 表达基因；表达基因； 速度快，效率高：一次速度快，效率高：一次SSH反应可以同时分离几十或成百个差异表达反应可以同时分离几十或成百个差异表达 基因；基因； 实验结果复杂程度低，实验结果复杂程度低，SSH技术由于采用了接头、差减杂交及两轮抑技术由于采用了接头、差减杂交及两轮抑 制性制性PCR扩增，可大量特异扩增那些代表了差异表达的扩增，可大量特异扩增那些代表了差异表达的cDNA片段，因片段，因 而减少了结果的复杂性。而减少了结果的复杂性。

38、 SSH的缺点的缺点 SSH技术的不足之处在于，每次只能比较两种样品之间基因表达的差技术的不足之处在于，每次只能比较两种样品之间基因表达的差 异；异； SSH依赖较高的依赖较高的Rsa消化效率和接头连接效率，否则不带接头的消化效率和接头连接效率，否则不带接头的tester cDNA的杂交方式将和的杂交方式将和driver cDNA相同，导致一些差异表达的相同，导致一些差异表达的cDNA得得 不到富集而丢失。同样地，如果两组不到富集而丢失。同样地，如果两组tester cDNA与接头的连接效率不同，与接头的连接效率不同， 也将丢失一些差异表达也将丢失一些差异表达cDNA；有时会产生嵌合；有时会产

39、生嵌合cDNA（几率为（几率为2%）；）； 起始材料需要起始材料需要 g 级量级量mRNA；SSH差减克隆片段较小，获取差减克隆片段较小，获取cDNA全全 长序列有一定难度；长序列有一定难度； SSH技术中所研究的材料的差异不宜太大，最好是只有细微差别。技术中所研究的材料的差异不宜太大，最好是只有细微差别。 DNA诱变 DNA诱变 定点突变 随机突变 定点突变 u 基于PCR的点突变 u 不依赖于PCR的定点诱变方法 基于PCR的点突变 重叠延伸PCR 法(Over-lap extension PCR ) 大引物PCR (Megaprimer PCR) 特殊位置碱基的定点突变 扩增环状质粒全长

40、的突变方法 重叠延伸PCR 法(Over-lap extension PCR ) 重叠延伸重叠延伸PCR法介导的定点突变原理图法介导的定点突变原理图 大引物PCR (Megaprimer PCR) 大引物大引物PCR 法流程（图中黑色实心三角形代表突变位点）法流程（图中黑色实心三角形代表突变位点） 特殊位置碱基的定点突变 唯一限制性位点删除法（唯一限制性位点删除法（unique site elimination technique，USE）原理图）原理图 （黑色实心三角形代表突变位点，实心椭圆代表酶切位点）（黑色实心三角形代表突变位点，实心椭圆代表酶切位点） PCR 介导定点诱变的优点 突变体

41、回收率高 在任何位点引入突变 降低模板DNA 形成二级结构的能力 可利用商业试剂盒 快速简便 PCR 介导定点诱变的缺点 PCR 产物有相对高的错误率 在扩增DNA 的3末端引入非预设的核苷 酸 每套引物和模板的条件都需要优化 以亲本野生型DNA 为模板的PCR反应中， 污染可导致高比例的非突变的克隆 不依赖于PCR的定点诱变方法 盒式诱变(Cassette mutagenesis) 寡核苷酸介导的诱变(Oligonucleotide-directed mutagenesis) Kunkel法 随机突变 PCR介导的随机突变 DNA 改组 StEP重组（重组（ Staggered Extens

42、ion Process） RAISE重组（重组（ Random In sertiona l-deletiona l Strand ExchangeMutagenesis） 随机引导重组（随机引导重组（ random-priming recombination，RPR） 第七节 转化、筛选与鉴定 一、重组DNA导入受体细胞 二、 重组子的筛选与鉴定 三、DNA序列测定 一、重组DNA导入受体细胞 （一）（一）受体细胞受体细胞（recepter cell）： 就是能够摄取外源DNA并能够使其稳定存在的细胞。 选择原则： （1）细胞要比较安全，无致病性或致病缺陷型，不会对外 界环境生物污染。 （2）

43、重组DNA分子导入受体细胞要方便。 （3）重组DNA分子要能够在该受体细胞内稳定存在。 （4）重组DNA分子的筛选要方便。 （5）遗传稳定性要高，利于扩大培养或长期培养。 （6）选择蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，以 利于稳定大量收集目的蛋白产物。 （二）（二）重组重组DNA导入原核细胞导入原核细胞 常用方法：接合，转导，转化，电穿孔。 1. Ca2+诱导大肠杆菌感受态转化法 : 基因原理：受体细胞经过CaCl2处理后，细胞膜的通透性 发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感 受态细胞。 2.电穿孔转化法 基本原理： 通过高强度的 电场作用，瞬 时提高细胞膜 的通透 性，即

44、形成可 逆的瞬时通道， 从而吸收周围 介质中的外源 分子。 3. 接合转化法 基本原理：通过供体细 胞同受体细胞间的直接 接触而传递外源DNA 的方法。 4. 噬菌体转导法 转导是噬菌 体介导的一 种DNA或 RNA转移过 程。 DNA 载体能够承 载较大的外 源DNA片段， 可以达到 4851kb。 二、 重组子的筛选与鉴定 （一）（一）依据载体的选择性标记对转化子进行初步筛选依据载体的选择性标记对转化子进行初步筛选 1. 抗药性筛选法：重组DNA载体上携带有受体细胞敏感的抗 生素抗性基因时，通常可以取用转化体系涂布含该抗生素的 选择培养平板的方法进行转化子的第一轮筛选。 常用的一种显色筛选法是蓝白斑筛选法，利用的是lacZ基 因的-互补原理，由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂 IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。 然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，破坏了 lacZ的N端片段，-互补也遭到破坏，因此使得带有重组质 粒的细菌形成白色菌落。 2. 显色筛选法 3. 营养缺陷型筛选法 基因原理: 突变型受体细胞上缺乏合成某种必需营养物质，