实时荧光定量PCR技术 (1)

1、Report Export Department Export Management Export Department Export Man Export Department Export Management Export Department Export Management E Export Department Export Management Export Department Export Management Exp 实时荧光定量PCR技术 Report 2011 内容概要 1荧光定量PCR的基本概念 1荧光定量PCR的标记方法 1荧光定量PCR解析方法 1 SYBR法实

2、验流程及注意事项 常规PCR与实时荧光定量PCR 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析 实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个 循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析 荧光定量PCR常用的三个概念 扩增曲线 荧光阈值 CT值 Cycle（循环数） Rn（荧光强度） Baseline Lgliner phase 平台期 荧光基团 荧光检测元件 扩增曲线 Cycle（循环数）（循环数） Rn（荧光强度）（荧光强度） Baseline Lgliner phase 1 前15个循环信号作为荧光 本底信号（basel

3、ine） 1 荧光阈值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏 差的10倍 1 手动设置：大于荧光背景 值和阴性对照的荧光最高值； 进入指数期的最初阶段 1 真正的信号:荧光信号超过 阈值 Threshold 荧光阈值 平台期平台期 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物 的荧光信号达到设定的阈值时 所经过的扩增循环次数 Cycle（循环数）（循环数） Rn（荧光强度）（荧光强度） Ct value Ct值 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点 处产物量不恒定；Ct值极具重 现性 Ct值的数学原理 理想的PCR反应： Xn=X02n 非理想的PCR反应： Xn=X0 (1+Ex

4、)n 方程式两边同时取对数得: log Xn=log X0 (1+Ex)n 整理方程式得: log X0= (- log (1+Ex) )n+ log Xn 将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得： log X0= (- log(1+Ex) ) C(t)+ log Xc(t) 初始浓度的对数与循环数呈线性关系 n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 Cycle number Ck 104 Ck 102 Sample Lg of DNA concentration 0 模板DNA量越多，荧光达到 阈值的循环数越少，即Ct值越小。

5、0 Log模板起始浓度与Ct值呈线 性关系。 Ct值与模板起始量的关系 qPCR 常用实验方法 p 简单 p 成本较低 p 适用于多重PCR p 特异性较好 p 可进行SNP检测 p 特异性非常好 ABC SYBR Green I 染料法原理 SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色 激发波长的染料 SYBR Green I 染料法作用机理 问题点：问题点： SYBR Green I与双链与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时

6、被检测，从而可能导致检测结果不准确。同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。 SYBR Green I染料法问题点与关键点 关键点：关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！设计合适引物，防止非特异性扩增！ 原始图谱原始图谱对数图谱对数图谱 SYBR Green I 染料法融解曲线 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确 SYBR Green I染料法融解曲线 % 使用方便，不必设计复杂 探针 % 具有价格优势 优 点 % 无模板特异性 % 对引物特异性要求较高 % 不能进行多重定量 % 灵敏度相对较低 缺 点 SYB

7、R Green I 染料法优缺点 Taqman探针法原理 + 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 + 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) + 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 + Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针 Taqman探针法工作机理 1、引物、探针的设计：、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段80 CT18-30 cycles R20.95 Slope(-3.58)-(-3.10) Efficiency90%-

8、110% NTC CT(NTC) =0 CT(NTC)CT(样品)5 NRC CT(NTC) =0 CT(NTC)CT(样品)5 MIQE qPCR国际标准 提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。 对QPCR的术语；概念；研究与临床应用；样本的采集、处理和制 备；核酸的质量控制；反转录；QPCR过程；数据分析等方面的操 作标准和规范都做了详尽的阐述。 Report Export Department Export Management Export Department Export Man Export Department Export Management Export Department Export Management E Export Department Export Management Export Department Export Management Export Department Expor