遗传实验人外周血培养与染

1、1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法；学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法； 2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本；利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本； 3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。 一、一、 实验目的：实验目的： 二、实验原理：二、实验原理： 1、植物血凝素的作用、植物血凝素的作用 外周血中的淋巴细胞几乎都是处在外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或或G1期，期， 一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物植物 血凝素血凝素(PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化时，这种小

2、淋巴细胞受到刺激后转化 为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。 2、秋水仙素的作用：、秋水仙素的作用： 秋水仙素秋水仙素(colchicine)可以抑制细胞纺锤体可以抑制细胞纺锤体 的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利 用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细 胞。胞。 使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度 上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。 3、低渗的原理：、低渗的原理： 徐道觉徐道

3、觉(T.C.Hsu)等于等于1952年发现在固定年发现在固定 细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核细胞的核 膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，染色体分散开来， 在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提 高。高。 4、核型和带型：、核型和带型： n核型核型(karyotype)： 是指染色体组在有丝分裂中期的表型是指染色体组在有丝分裂中期的表型这种技术这种技术 被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。 , 是染色体数目、大小、

4、形态特征的总和。是染色体数目、大小、形态特征的总和。 在对染色体进行测量计算的基础上在对染色体进行测量计算的基础上, 进行分组、进行分组、 排队、配对排队、配对, 并进行形态分析的过程叫并进行形态分析的过程叫核型分析核型分析。 将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画 下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为 核型模式图核型模式图，它代表一个物种的核型模式。，它代表一个物种的核型模式。 n带型带型（banding pattern） 即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序，即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序，

5、 使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数 目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性， 所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带 型。型。 常用的显带技术所显示的带有常用的显带技术所显示的带有Q带、带、G带、带、C 带、带、R带、带、T带带等。就每一种分带技术而言，每一等。就每一种分带技术而言，每一 染色体的带型是高度专一和恒定的。染色体的带型是高度专一和恒定的。 三、实验用具及试剂：三、实验用具及试剂： 1.实验仪器及用具：实验仪器及用具： 恒温培养箱、离心机、恒

6、温水浴箱恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱 、冰、冰 箱箱 、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析 仪；仪； 培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、 离心管离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。、载玻片、烧杯、量筒。 . 2. 实验试剂：实验试剂： 外周血淋巴细胞培养基外周血淋巴细胞培养基 2%碘酒碘酒 75%酒精酒精 20g/ml秋水仙素秋水仙素 0.075 mol/L KCl溶液溶液 甲醇甲醇 冰醋酸冰醋酸 Giemsa原液原液 1/15 mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液 四、实验步骤：四、实验步骤： 1、采血：采

7、血：将皮肤常规消毒后静脉采血约将皮肤常规消毒后静脉采血约 0.5 ml。 2、种血及培养：种血及培养：将采到的血样立即接种到培养瓶内，将采到的血样立即接种到培养瓶内， 每个培养瓶接每个培养瓶接2528滴（约滴（约0.5ml），轻轻摇匀后），轻轻摇匀后 将培养瓶放在将培养瓶放在37温箱中培养温箱中培养72小时。培养过程小时。培养过程 中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。 3、秋水仙素处理：秋水仙素处理：在终止培养前在终止培养前3-4小时，向培养小时，向培养 瓶中加瓶中加 20g/ml的秋水仙素的秋水仙素20l，轻轻摇匀后继，轻轻摇匀后继 续培养到续培养到72小时。小时。

8、4、制片：、制片： （1）离心：离心：从温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转从温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转 入入10ml的刻度离心管内。的刻度离心管内。2000转转/分，离心分，离心10分钟。分钟。 （2）低渗：低渗：弃去上清液。加入弃去上清液。加入37预热的预热的0.075 mol/L KCl 低渗液低渗液6-8ml，用吸管轻轻吹打均匀，用吸管轻轻吹打均匀， 放在放在37恒温水浴中恒温水浴中40分钟。分钟。 (此时配固定液：甲醇此时配固定液：甲醇225ml+冰醋酸冰醋酸75ml ) （3）预固定：预固定：在离心管中加入现配的预温的甲醇在离心管中加入现配的预温的甲醇-冰冰 醋酸醋酸(3:1

9、)固定液约固定液约1ml，轻轻混匀，轻轻混匀，37固定固定15分分 钟。钟。 （4）再次离心再次离心：2000转转/分离心分离心10分钟。分钟。 （5）第一次固定第一次固定：弃上清液，加入固定液约：弃上清液，加入固定液约7ml， 立即用吸管吹打使之成细胞悬液，室温固定立即用吸管吹打使之成细胞悬液，室温固定20分钟。分钟。 2000转转/分离心分离心10分钟。分钟。 （6）第二次固定第二次固定：同第一次固定。：同第一次固定。 （7）弃上清液弃上清液，根据沉淀量的多少，加入适量固，根据沉淀量的多少，加入适量固 定液定液68滴，用吸管吹打使均匀后制成细胞悬液。滴，用吸管吹打使均匀后制成细胞悬液。 （

10、8）滴片：滴片：在在30-40cm高处将细胞悬液滴在预冷的高处将细胞悬液滴在预冷的 载玻片上，注意动作应迅速，避免载片升温。载玻片上，注意动作应迅速，避免载片升温。 （9）染色：染色：用用10%吉姆萨染液扣染吉姆萨染液扣染30分钟，染色结分钟，染色结 束后用清水将浮色冲去，干燥后即可进行镜检。束后用清水将浮色冲去，干燥后即可进行镜检。 （10）照相：照相：在显微镜下寻找分散较好的分裂相在显微镜下寻找分散较好的分裂相(核核 型型)，再置于显微照相仪下拍摄照片，并保存。，再置于显微照相仪下拍摄照片，并保存。 （11）核型分析：核型分析：应用核型分析软件，进行染色体应用核型分析软件，进行染色体 核型

11、分析。核型分析。 核型分析仪及核型分析核型分析仪及核型分析 五、注意事项五、注意事项: 1、秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体、秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体 短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。 故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。 2、低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处、低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处 理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻， 否则引起膜破裂、染色体散失。否则引起膜破裂、染色体散失。 3、离心前配平，离心

12、速度过高，细胞团不易打散；、离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散； 反之，细胞易丢失。反之，细胞易丢失。 4、固定液应在使用前临时配制。、固定液应在使用前临时配制。 5、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。 六、实验结果与分析：六、实验结果与分析： 染色体核型分析：人类每个体细胞有染色体核型分析：人类每个体细胞有 46条染色体，条染色体，22对常染色体和一对性染色对常染色体和一对性染色 体，男性为体，男性为46，XY；女性为；女性为46，XX。 A组（组（No.1 3）：是最大的一组染色体，它们的）：是最大的一组染色体，它们的 着丝粒在中部或几乎在

13、中部，为中部着丝粒染色着丝粒在中部或几乎在中部，为中部着丝粒染色 体；体； B组（组（N0.45）：为两对大的亚中部着丝粒染色）：为两对大的亚中部着丝粒染色 体，它们有明显的长臂和短臂；体，它们有明显的长臂和短臂； C组（组（N0.612+X）：为中等大小的亚中部着丝）：为中等大小的亚中部着丝 粒染色体，它们大小相差不多，粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介染色体大小介 于期间，一般难以区分；于期间，一般难以区分； D组（组（N0.1315）：为中等大小的近端着丝粒染）：为中等大小的近端着丝粒染 色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是 一对着

14、色很深的小球，处于短臂的末断，随体与一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与 短臂之间的区域很少着色；短臂之间的区域很少着色； 人类染色体分组人类染色体分组 E组（组（N0.1618）：包括一对中着丝粒染色体）：包括一对中着丝粒染色体 （16）和两对亚中着丝粒染色体（）和两对亚中着丝粒染色体（17、18）；）； F组（组（N0.1920）：为两对小的中部着丝粒染色）：为两对小的中部着丝粒染色 体；体； G组（组（N0.2122+Y）：为最小的一组近端着丝粒）：为最小的一组近端着丝粒 染色体，在染色体，在N0.2122的短臂上可见随体。的短臂上可见随体。Y染染 色体常呈现异固缩状态，着色更深，

15、可以识别。色体常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。 人类染色体核型分析结果人类染色体核型分析结果 重要参数：重要参数： （1）染色体的相对长度）染色体的相对长度 （2）臂比率）臂比率 （3）着丝点指数）着丝点指数 七、作业及思考题：七、作业及思考题： 1、将分散良好的标本进行显微照相；、将分散良好的标本进行显微照相； 2、观察人类染色体的形态、结构特点；、观察人类染色体的形态、结构特点； 3、对比男性和女性的染色体标本，比较异同；、对比男性和女性的染色体标本，比较异同； 4、总结做好本实验的关键因素。、总结做好本实验的关键因素。 八、参考文献：八、参考文献： n医学遗传学基础与临床医学遗传学

16、基础与临床.程在玉，伦玉兰程在玉，伦玉兰.山山 东：青岛出版社，东：青岛出版社，1993. n遗传学实验教程遗传学实验教程.王建波，方呈祥等编王建波，方呈祥等编. 武武 汉：武汉出版社，汉：武汉出版社，2004. n外周血培养染色体失败的原因分析外周血培养染色体失败的原因分析.李庆，李庆， 王秉仪，洪美玲等王秉仪，洪美玲等. 解放军医学高等专科学解放军医学高等专科学 校学报，校学报，1999(1)：72. （完）（完） 核型核型 带型带型 返回返回 正正 常常 男男 性性 核核 型型 G AB C DE F 返回返回 2、秋水仙素的作用：、秋水仙素的作用： 秋水仙素秋水仙素(colchicin

17、e)可以抑制细胞纺锤体可以抑制细胞纺锤体 的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利 用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细 胞。胞。 使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度 上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。 n带型带型（banding pattern） 即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序，即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序， 使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数 目

18、、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性， 所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带 型。型。 常用的显带技术所显示的带有常用的显带技术所显示的带有Q带、带、G带、带、C 带、带、R带、带、T带带等。就每一种分带技术而言，每一等。就每一种分带技术而言，每一 染色体的带型是高度专一和恒定的。染色体的带型是高度专一和恒定的。 三、实验用具及试剂：三、实验用具及试剂： 1.实验仪器及用具：实验仪器及用具： 恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱 、冰、冰 箱箱 、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析 仪；仪； 培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、 离心管离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。、载玻片、烧杯、量筒。 . 2. 实验试剂：实验试剂： 外周血淋巴细胞培养基外周血淋巴细胞培养基 2%碘酒碘酒 75%酒精酒精 20g/ml秋水仙素秋水仙素 0.075 mol/L KCl溶液溶