重组超氧化物歧化酶1-3杂合酶在大肠杆菌中表达优化

1、重组超氧化物歧化酶1/3杂合酶在大肠杆菌中表达优化 摘要：目的获取活性高的重组SOD 1/3杂合酶。方法用含pET-SOD 1/3的工程菌诱导表达重组SOD 1/3杂合酶，通过分析SDS-PAGE及SOD酶活性，考察诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、Cu2+、Zn2+浓度对重组酶表达量和活性的影响。结果正交试验表明，用1 mmol/L 异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在A600 =1.2时诱导，Cu2+、Zn2+浓度分别为2.4 mmol/L，诱导温度15 ，诱导时间12 h，能获得高活性重组SOD 1/3，其比活性为1 681 U/mg。结论培养温度和Cu2+、Zn2+浓度是优化表达的最主

2、要因素。降低诱导温度有利于重组酶的可溶性表达，添加Cu2+、Zn2+能促进重组酶活性提高。 关键词：超氧化物歧化酶；杂合酶；表达；优化 中图分类号：Q554文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)11-0008-04 Optimal Expression of Recombinant Hybrid Enzyme SOD1/3 in E. coli SONG Xiao-ling, FAN Li-qiang*, RONG Zhi-feng, ZHAO Jian*, LI Su-xia, YUAN Qin-sheng (State Key Laboratory of Bioreacto

3、r Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China) Abstract：Objective To obtain recombinant hybrid enzyme SOD1/3 with higher activity in E. coli. Methods The recombinant bacteria containing expression plasmid pET-SOD1/3 was used to express hybrid enzyme SOD1/3. T

4、he effects of induction temperature, induction time, IPTG concentration and Cu2+ or Zn2+ concentration on the expression amount and activity of recombinant hybrid enzyme SOD1/3 were investigated by SDS-PAGE and SOD activity assay. Results When the recombinant bacteria were cultured at 15 for 12 h wi

5、th 2.4 mmol/L Cu2+ or Zn2+ and 1 mmol/L IPTG at A600=1.2, the activity of hybrid enzyme SOD1/3 was higher with specific activity of 1 681U/mg. Conclusion The optimal expression of hybrid enzyme SOD1/3 is mainly affected by induction temperature and Cu2+ or Zn2+ concentration. Hybrid enzyme SOD1/3 ca

6、n be expressed in supernatant at low temperature. The addition of Cu2+ or Zn2+ can increase the activity of hybrid enzyme SOD1/3. Key words：superoxide dismutase; hybrid enzyme; expression; optimization 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的金属酶。人体内SOD有3种：细胞内Cu, ZnSOD（SOD1）、线粒体中MnSOD（SOD2

7、）和胞外Cu, Zn EC-SOD（SOD3）。作为O2-清除剂，SOD广泛用于防辐射、抗衰老、防治肿瘤等方面1,2。目前，对Cu, ZnSOD的研究较深入全面，但其体内半衰期短（6min），不能与内皮细胞特异性的结合等，限制了它的应用。EC-SOD恰能弥补这些不足，但它在原核和酵母系统中的表达效果不理想3-5，不能大量制备。为此我们构建了表达含有SOD1和SOD3 C端肽编码序列的杂合酶的工程菌。本研究以此重组菌为材料，考察了诱导剂、诱导表达时间、培养温度、Cu2+、Zn2+浓度及诱导时菌体密度等对表达的影响，以期为工业化生产奠定基础。 1材料与仪器 1.1仪器 高速冷冻离心机（BIOFUG

8、E-28RS，德国）；超声波细粉破碎机（JY92-，宁波新芝科学仪器研究所）；回转式恒温调速摇瓶培养柜（HYG-，上海新蕊自动化设备公司）；紫外分光光度计（UV-2100，UNI-CO）；电泳槽（HOEFER，美国）。 1.2实验材料与试剂 重组质粒pET-SOD1/3、大肠杆菌菌株BL21(DE3)均系本课题组保存；硫酸卡那霉素（Kana，Amreseo分装，Genebase生物公司）；IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷，Genebase生物公司）；胰蛋白胨和酵母提取物（Oxoid Ltd，英国）；连苯三酚（E.Merk，BP）；丙烯酰胺（进口分装，上海源聚生物科技公司）；N,N-亚甲基双丙

9、烯酰胺（Fluka公司）。其它试剂均为国产分析纯。 2方法 2.1重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）的表达 将重组表达质粒pET-SOD 1/3转化入E.coli BL21（DE3），涂布于含卡那霉素的LB平板上。挑取单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中，37 摇瓶培养12 h后，按2 %的接种量翻瓶，至A600 =0.40.6时，用IPTG诱导。培养结束后，将悬浮液离心，菌体经洗涤后用50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0重新悬浮，超声（功率400 W，时间5 s，间隔5 s，共60次）破碎菌体，离心后收集上清液，SDS-PAGE分析蛋白质的表达，测定SOD活性和蛋白质浓度。

10、2.2温度对蛋白质表达的影响 37 培养重组菌至A600 =0.40.6时，加入终浓度0.5 mmol/L的 IPTG诱导，分别于37，25，20，15 继续培养，收集菌体，处理后通过SDS-PAGE电泳分析蛋白质的表达。 2.3时间对蛋白质表达的影响 37 培养重组菌至A600 =0.40.6时，加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG诱导，间隔2 h取样1次，共7次，SDS-PAGE分析蛋白质的表达。 2.4诱导剂IPTG浓度对蛋白质表达的影响 其它条件不变，IPTG终浓度分别为0，0.25，0.5，0.75，1 mmol/L诱导表达12 h后收集菌体，处理后SDS-PAGE分析蛋白质的表

11、达。 2.5Cu2+、Zn2+浓度对蛋白质表达的影响 取培养基中直接加入、诱导时加入和诱导后超声波破碎液中加入3种方式分别加入0.3，0.9，1.2 mmol/L的Cu2+、Zn2+，以不加Cu2+、Zn2+的样品为对照，比较超声波处理前后上清液中SOD的活性。 2.6正交试验优化重组蛋白质的表达 采用5因素4水平正交试验考察诱导温度、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间和Cu2+、Zn2+协同效应对蛋白质表达的影响，确定优化后的表达条件。 3结果 3.1SOD1/3杂合酶在大肠杆菌中的表达 将pET-SOD1/3重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，以空载菌体为对照，37 培养至A600=0.

12、40.6时，加入终浓度1 mmol/L IPTG诱导表达4 h，离心收集菌体，超声波破碎后离心，分别收集上清液和沉淀，SDS-PAGE分析，结果见图1。由图1可见，重组菌在Mr约30 000处有明显的蛋白质表达条带，与SOD1/3杂合酶的理论Mr相符。表达产物既有可溶性蛋白质，也有不可溶的包涵体。 M. marker；1. 空载菌体超声波破碎后上清液；2. 诱导表达后超声波破碎上清液；3. 诱导表达后超声波破碎沉淀（包涵体） 图 1pET28a-SOD1/3在BL21(DE3)中的表达 3.2诱导温度对杂合酶SOD 1/3表达的影响 结果见图2。37 表达，80 %表达产物以无活性包涵体形式存

13、在；随着温度降低，可溶蛋白质比例逐渐增高；25 表达，无活性包涵体占总表达蛋白质50 %以上；温度降至20 和15 时，几乎所有蛋白质均以可溶形式存在。 M. marker；1. 未诱导的菌体；2. 15 诱导时产生的包涵体；3. 15 诱导时的上清液；4. 20 诱导时的包涵体；5. 20 诱导时的上清液； 6. 25 诱导时的包涵体；7. 25 诱导时的上清液；8. 37 诱导时的包涵体；9. 37 诱导时的上清液 图2温度对SOD1/3表达的影响 3.3诱导时间对SOD 1/3杂合酶表达的影响 15 下诱导，不同时间后收集菌体，SDS-PAGE分析，结果见图3。诱导2 h后，重组杂合酶表

14、达量非常低；随诱导时间延长，重组杂合酶表达量逐渐增加，10 h后基本稳定。 M. marker；1. 未诱导的菌体；2. 诱导2 h；3. 诱导4 h；4. 诱导6 h；5. 诱导8 h；6. 诱导10 h；7. 诱导12 h 图315 不同诱导时间对重组蛋白表达的影响 3.4诱导剂IPTG浓度对SOD1/3表达的影响 结果见图4。无IPTG诱导，目的蛋白质无明显表达；相同诱导时间，IPTG加入量越大，SOD 1/3表达量越多，且有易形成包涵体的趋势。 M. marker；1. 无IPTG诱导时离心沉淀物；2. 无IPTG诱导时上清液；3. 0.25 mmol/L IPTG诱导时包涵体；4.

15、0.25 mmol/L IPTG诱导时上清液；5. 0.5 mmol/L IPTG诱导时包涵体；6. 0.5 mmol/L IPTG诱导时上清液；7. 0.75 mmol/L IPTG诱导时包涵体； 8. 0.75 mmol/L IPTG诱导时上清液；9. 1 mol/L IPTG诱导时上清液；10. 1 mol/L IPTG诱导时包涵体 图4IPTG浓度对SOD1/3表达的影响 3.5Cu2+、Zn2+对SOD1/3表达活性的影响 由于SOD1、SOD3都是含Cu2+、Zn2+的金属酶。培养基中本身的Cu2+、Zn2+的量不能满足大量重组酶的需要，故在上清液中添加Cu2+、Zn2+，测试其对

16、重组杂合酶活性的影响，结果见表1。表明Cu2+、Zn2+能明显提高SOD融合蛋白质活性，且15 诱导表达的SOD活性高于37 诱导结果。 加入Cu2+、Zn2+能增加重组酶的活性，为探索添加方式的影响，采取培养基直接加入，诱导时加入和诱导后超声破碎液中加入3种方式，结果见图5。直接在LB培养基中添加Cu2+、Zn2+最方便，且重组酶的活性最高，故用此方式进一步研究。 表 1Cu2+和Zn2+对不同温度诱导时重组蛋白质活性的影响 1. 直接在LB培养基中加入Cu2+、Zn2+；2. 诱导过程中加入Cu2+，Zn2+；3. 不添加Cu2+、Zn2+；4. 超声破碎上清液中加入Cu2+、Zn2+；5

17、. 空载对照 pET28a/BL21(DE3)在LB培养基中加Cu2+、Zn2+ 图5Cu2+，Zn2+的添加方式对酶活性的影响 图6显示培养基中添加不同浓度Cu2+、Zn2+，表达产物SOD活性的差异。随离子加入量的增加，重组酶活性迅速上升，但上升幅度逐渐降低。 图6Cu2+，Zn2+浓度对重组酶活性的影响 3.6正交试验的结果 众多因素同时影响重组酶的活性与表达，我们进一步用5因素4水平的正交试验筛选最佳表达条件。待筛选的5个因素（培养温度、IPTG浓度、诱导前菌体A600、诱导时间、Cu2+、Zn2+浓度）和4个水平，正交结果及分析见表2、表3。 表3正交试验分析表 正交结果分析表明，影

18、响重组酶表达活性的因素依次为培养温度表达时菌体浓度A600 Cu2+、Zn2+浓度诱导剂IPTG加入量诱导时间，但是均无显著差异（P0.1）。最优化组合为含2.4 mmol/L Cu2+和Zn2+的培养基在A6001.2时用终浓度1 mmol/L IPTG诱导，15 继续培养12 h后收集菌体。在此条件表达重组酶，其比活性可达1 681 U/mg。 4结论 通过测试诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间、Cu2+和Zn2+浓度的影响，优化了兼有EC-SOD细胞靶向性和Cu, Zn-SOD清除自由基功能的重组杂合酶工程菌的表达条件。低温诱导能促使可溶性SOD1/3杂合酶表达；培养基中加入酶活性中心的金属辅因子Cu2+、Zn2+能有效地提高重组蛋白酶的活性。为后续EC-SOD C端肽靶向性的研究，SOD1/3杂合酶的开发利用奠定了基础。 参考文献 1Bowler R P, Crapo J D. Oxidative stress in airways: is there a role for extracellularsuperoxide dismutase J. Am J Respir Crit Care Med, 2002, 166: 38-43. 2张宝，周玫. 细胞外超氧化物歧化酶EC