药物化学复习课件

1、药物化学复习1 药物筛选复习课 药物化学复习2 选择药物作用靶标的考虑因素选择药物作用靶标的考虑因素 1靶标的有效性，即靶标与疾病确实相关，靶标的有效性，即靶标与疾病确实相关， 并且通过调节靶标的生理活性能有效地改并且通过调节靶标的生理活性能有效地改 善疾病症状。善疾病症状。 2靶标的副作用，如果对靶标的生理活性靶标的副作用，如果对靶标的生理活性 的调节不可避免地产生严重的副作用，那的调节不可避免地产生严重的副作用，那 么将其选作药物作用靶标是不合适的。么将其选作药物作用靶标是不合适的。 药物化学复习3 从天然资源中寻找微生物先导药从天然资源中寻找微生物先导药 的一般流程的一般流程 1.采集采

2、集各种来源的样品各种来源的样品 2.根据不同的分离要求进行根据不同的分离要求进行处理处理 3.对各类微生物对各类微生物分离分离纯化纯化 4.分离菌株的分离菌株的培养、发酵培养、发酵 5.应用各种模型对发酵产品进行高通量应用各种模型对发酵产品进行高通量筛选筛选 6.对对活性物质活性物质进行化学进行化学分离纯化及结构测定分离纯化及结构测定 7.活性物质体内外活性物质体内外活性评价活性评价 8.先导化合物的先导化合物的结构优化及深入研发结构优化及深入研发 9.放大放大发酵积累量进行发酵积累量进行临床研究临床研究 药物化学复习4 影响微生物合成的主要因素影响微生物合成的主要因素 影响其合成效率的主要因

3、素有：所用微生物的种类、底影响其合成效率的主要因素有：所用微生物的种类、底 物、酶、培养基类型、温度等。物、酶、培养基类型、温度等。 （一）（一）微生物微生物 微生物种类不同，其代谢以及合成的产物的结构类型乃至微生物种类不同，其代谢以及合成的产物的结构类型乃至 生物活性多不相同，扩大微生物的来源是寻找新的微生物生物活性多不相同，扩大微生物的来源是寻找新的微生物 产物的有效途径之一产物的有效途径之一 （二）（二）酶及底物酶及底物 由于生物合成酶的底物专一性较低，在其野生型菌株或阻由于生物合成酶的底物专一性较低，在其野生型菌株或阻 断突变株的发酵过程中添加一些结构类似物可作为前体产断突变株的发酵过

4、程中添加一些结构类似物可作为前体产 生新的微生物产品生新的微生物产品 （三）其他（三）其他培养条件培养条件 微生物体具有的合成能力在适宜其生长的条件下会增强，微生物体具有的合成能力在适宜其生长的条件下会增强， 也会因改变培养基成分而随之也会因改变培养基成分而随之变化，当环境不利时则会变化，当环境不利时则会 抑制其合成。抑制其合成。 药物化学复习5 微生物发酵法微生物发酵法 发酵是利用未固定的微生物在发酵罐中生长来获发酵是利用未固定的微生物在发酵罐中生长来获 得所需产品，能够进行批次性的生产；得所需产品，能够进行批次性的生产； 发酵罐通常为含微生物营养基的大槽或大桶。发发酵罐通常为含微生物营养基

5、的大槽或大桶。发 酵罐常配有能够调节培养基温度、酵罐常配有能够调节培养基温度、pH和氧气含量和氧气含量 的调节器；的调节器； 典型的培养基含碳源如葡萄糖、水合淀粉或果糖；典型的培养基含碳源如葡萄糖、水合淀粉或果糖； 蛋白质或氮源如大豆粉、玉米汤或棉籽粉；蛋白质或氮源如大豆粉、玉米汤或棉籽粉； 维生素源如酵母提取物；矿物质和其他混合性营维生素源如酵母提取物；矿物质和其他混合性营 养物。养物。 药物化学复习6 初级代谢与次级代谢初级代谢与次级代谢 一般将微生物通过一般将微生物通过代谢活动代谢活动所产生的所产生的自身繁殖所必需自身繁殖所必需的物的物 质和能量的过程，称为初级代谢，该过程所产生的产物即

6、质和能量的过程，称为初级代谢，该过程所产生的产物即 为初级代谢产物，如氨基酸、核苷类，以及酶或辅酶等。为初级代谢产物，如氨基酸、核苷类，以及酶或辅酶等。 微生物的初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，微生物的初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质， 通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物物 质和能量的过程。质和能量的过程。 次级代谢与初级代谢关系密切，次级代谢与初级代谢关系密切，次级代谢次级代谢是指微生物在一是指微生物在一 定的生长时期，以初级代谢的关键性中间产物为前体物质，定的生长时期，以初级代谢的关键性中间产物为前体物质，

7、合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程， 这一过程的产物，即为次级代谢产物。这一过程的产物，即为次级代谢产物。 次级代谢产物在微生物生命活动过程中的产生极其微量，次级代谢产物在微生物生命活动过程中的产生极其微量， 对微生物对微生物本身的生命活动没有明显作用本身的生命活动没有明显作用，当次级代谢途径，当次级代谢途径 被阻断时，菌体生长繁殖仍不会受到影响。被阻断时，菌体生长繁殖仍不会受到影响。 药物化学复习7 微生物固定法微生物固定法 细胞固定就是细胞固定就是将微生物种在一个不溶的细胞将微生物种在一个不溶的细胞 性或非细胞性模块性或非细胞

8、性模块上，模块可以是合成的聚上，模块可以是合成的聚 合物、生物聚合物或微生物体本身。合物、生物聚合物或微生物体本身。 微生物固定有微生物固定有种常用的方法，包括在模块中种常用的方法，包括在模块中 诱导诱导、模块上、模块上吸附吸附、压缩压缩入模块、与模块以入模块、与模块以 共价键结合共价键结合、细胞间的化、细胞间的化学交叉结合学交叉结合以及絮以及絮 凝，最常用的是诱导。凝，最常用的是诱导。 药物化学复习8 基因突变的种类基因突变的种类 根据遗传信息的改变方式，可分为同义突变、错义突变和无义突变三根据遗传信息的改变方式，可分为同义突变、错义突变和无义突变三 种。种。 同义突变：改变后的密码子和改变

9、前的密码子是简并密码子，它们编同义突变：改变后的密码子和改变前的密码子是简并密码子，它们编 码同一种氨基酸，这种基因突变称为同义突变码同一种氨基酸，这种基因突变称为同义突变 错义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码错义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码 子变为决定另一种氨基酸的密码子的基因突变叫错义突变。这种基因子变为决定另一种氨基酸的密码子的基因突变叫错义突变。这种基因 突变有可能使它所编码的蛋白质部分或完全失活突变有可能使它所编码的蛋白质部分或完全失活 无义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码无义突变：由于一对或几对碱基对的改变

10、而使决定某一氨基酸的密码 子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变。其中密码子改变为子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变。其中密码子改变为 UAG的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成UAA的无义突变又叫的无义突变又叫 赭石突变赭石突变 药物化学复习9 基因突变的特点基因突变的特点 1、基因突变在生物界中是普遍存在的、基因突变在生物界中是普遍存在的 2、基因突变是随机发生的。它可以发生在生物个、基因突变是随机发生的。它可以发生在生物个 体发育的任何时期和生物体的任何细胞体发育的任何时期和生物体的任何细胞 3、在自然状态下，对一种生物来说，基因突变的、在自然

11、状态下，对一种生物来说，基因突变的 频率是很低的频率是很低的 4、大多数基因突变对生物体是有害的、大多数基因突变对生物体是有害的 5、基因突变是不定向的。一个基因可以向不同的、基因突变是不定向的。一个基因可以向不同的 方向发生突变，产生一个以上的等位基因方向发生突变，产生一个以上的等位基因 药物化学复习10 基因突变与药物靶标的发现及应用基因突变与药物靶标的发现及应用 在基因水平上寻找药物靶标过程：在基因水平上寻找药物靶标过程： 1寻找疾病相关生物分子线索：利用基因突变技寻找疾病相关生物分子线索：利用基因突变技 术获取疾病相关的生物分子信息，并进行生物信术获取疾病相关的生物分子信息，并进行生物

12、信 息学分析，获取线索。息学分析，获取线索。 2对相关的生物分子进行功能研究，以确定候选对相关的生物分子进行功能研究，以确定候选 药物作用靶标。药物作用靶标。 3候选药物作用靶标，设计基因突变的候选药物作用靶标，设计基因突变的DNA及其及其 多肽在分子、细胞和整体动物水平上进行药理学多肽在分子、细胞和整体动物水平上进行药理学 研究。研究。 4验证靶标的有效性。验证靶标的有效性。 药物化学复习11 What is a microarray? Microarray或或Biochip（生物芯片）是一种微型多参数生（生物芯片）是一种微型多参数生 物传感器。它通过在一微小的基片表面固定大量的分子识物传感

13、器。它通过在一微小的基片表面固定大量的分子识 别探针，或构建微分析单元和系统，实现对化合物、蛋白别探针，或构建微分析单元和系统，实现对化合物、蛋白 质、核酸、细胞或其它生物组分准确、快速、大信息量的质、核酸、细胞或其它生物组分准确、快速、大信息量的 筛选或检测。筛选或检测。 Amicroarrayisanorderedarrayofmicroscopicelements onaplanarsubstratethatallowsthespecificbindingof genesorgeneproducts. 药物化学复习12 蛋白质芯片蛋白质芯片 蛋白质芯片是将各种蛋白质有序地固定在玻片、凝胶

14、、微蛋白质芯片是将各种蛋白质有序地固定在玻片、凝胶、微 孔板等各种载体上形成密集蛋白质芯片，用来高通量地测孔板等各种载体上形成密集蛋白质芯片，用来高通量地测 定蛋白质的生物活性，如酶活性、蛋白质一蛋白质问及蛋定蛋白质的生物活性，如酶活性、蛋白质一蛋白质问及蛋 白质一其它分子，如蛋白质一白质一其它分子，如蛋白质一DNA、蛋白质一配基问的相、蛋白质一配基问的相 互作用。互作用。 药物化学复习13 免疫共沉淀免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation) 免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗）是以抗 体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋体和抗

15、原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋 白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在 完整细胞内生理性相互作用的有效方法。完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其基本原理是其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形细胞裂解液中加入抗体，与抗原形 成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物， 然后进行然后进行SDS-PAGE及及Westernblotting分析。分析。 药物化学复习14 特点特点 优点：优点： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然

16、状态； （2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影 响；响； （3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为： 缺点：缺点： （1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中 间起桥梁作用；间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，）必须在实验前预测目的蛋白是什

17、么，以选择最后检测的抗体， 所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 药物化学复习15 放射免疫性检测放射免疫性检测(RIA，Radioimmunoassay） 放射免疫性检测放射免疫性检测(RIA，Radioimmunoassay)的基本的基本 原理是原理是 利用标记抗原利用标记抗原(Ag*)和非标记抗原和非标记抗原(Ag)对特异性抗对特异性抗 体体(Ab)发生竞争性结合，用已知不同浓度的标准物发生竞争性结合，用已知不同浓度的标准物 和一定量的和一定量的Ag*及限量的及限量的Ab反应，采取一定方法将反应，采取一定方法将

18、 Ag*-Ab与与Ag*分开，即可算出该标准物在各浓度下分开，即可算出该标准物在各浓度下 Ag*-Ab复合物的结合百分率。复合物的结合百分率。 然后，加入要筛选的目标物在标准曲线上即可查出然后，加入要筛选的目标物在标准曲线上即可查出 样品中是否含有要筛选的目标物及其浓度。样品中是否含有要筛选的目标物及其浓度。 药物化学复习16 亲和闪烁检测法亲和闪烁检测法Scintillation ProximityAssay,SPA 该技术使用能产生冷光的特制平板或圆球微粒，其底该技术使用能产生冷光的特制平板或圆球微粒，其底 部或外层包被着连接分子，通过化学处理可使抗体、部或外层包被着连接分子，通过化学处理

19、可使抗体、 受体蛋白质和酶偶联到含闪烁的微球体（荧光微球体受体蛋白质和酶偶联到含闪烁的微球体（荧光微球体 或或SPA）的表面上，当其和同位素标记的配体特异性）的表面上，当其和同位素标记的配体特异性 结合，近距离释放射线能量激发产生冷光，继而被探结合，近距离释放射线能量激发产生冷光，继而被探 测器所监测；不能特异性结合的小分子，其标记同位测器所监测；不能特异性结合的小分子，其标记同位 素所发出的射线能量大部分被水溶液散射，而不足以素所发出的射线能量大部分被水溶液散射，而不足以 激发产生冷光。可使用闪烁计数器方便地测定。激发产生冷光。可使用闪烁计数器方便地测定。 药物化学复习17 Homogene

20、ous Assays One-pot assays with no transfer or wash steps All the reagents are added in one step or in multisteps The signal is read in a plate reader Heterogeneous Assays 多步筛选：多步筛选：multiple additions/incubations/washings/ transfers/filtrations/readings of the signal Labor intensive, complicated step

21、, hard to automate 药物化学复习18 SPR基本原理基本原理 它利用它利用P P偏振光在玻偏振光在玻 璃与金属薄膜界面璃与金属薄膜界面 处发生全内反射时处发生全内反射时 渗透到金属薄膜内渗透到金属薄膜内 的消失波的消失波, ,引发金属引发金属 中的自由电子产生中的自由电子产生 表面等离子体表面等离子体, , 当当 表面等离子体与消表面等离子体与消 失波的频率相等时失波的频率相等时, , 二者将发生共振二者将发生共振, ,界界 面处的全反射条件面处的全反射条件 将被破坏将被破坏,呈现衰减呈现衰减 全反射现象，全反射现象，入射入射 光被光被金属表面电子金属表面电子 吸收吸收, ,

22、使反射光能量使反射光能量 急剧下降急剧下降 药物化学复习19 SPR的优点的优点 待测物无需标记待测物无需标记 适用于混浊、不透明或者有色溶液适用于混浊、不透明或者有色溶液 能实时、连续监测反应动态过程能实时、连续监测反应动态过程 检测方便、快捷检测方便、快捷 应用范围广，检测灵敏度高应用范围广，检测灵敏度高 始终保持生物分子的活性始终保持生物分子的活性 药物化学复习20 SPR缺点缺点 难以区分非特异性吸附难以区分非特异性吸附 对温度、样品组成等干扰因素敏感对温度、样品组成等干扰因素敏感 多步结合和多价结合的干扰多步结合和多价结合的干扰 空间位阻效应空间位阻效应 配体或者分析物的不均一配体或

23、者分析物的不均一 扩散速度的限制扩散速度的限制 重结合现象重结合现象 药物化学复习21 SPR的应用的应用 对生物分子进行识别及定量检测对生物分子进行识别及定量检测 研究生物分子间的相互作用研究生物分子间的相互作用 用用SPR可获得的信息：可获得的信息： 两个分子之间结合的特异性两个分子之间结合的特异性 目标分子的浓度目标分子的浓度 结合以及解离过程的动力学参数结合以及解离过程的动力学参数 1. 结合的强度结合的强度 药物化学复习22 报告基因检测报告基因检测 报告基因检测（报告基因检测（reportgeneassay） 报告基因报告基因(reportergene) 是一种编码可被检测的蛋白质

24、或酶的基因，也就是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就 是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。 把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成 嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序 列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标 定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 药物化学复习23 报告基因的特点：报告基因的特点： (1)已被克隆和全序列已测定；已被克隆和全序列已测定； (2)

25、表达产物在受体细胞中不存在，即无背表达产物在受体细胞中不存在，即无背 景，在被转染的细胞中无相似的内源性表景，在被转染的细胞中无相似的内源性表 达产物；达产物； (3)其表达产物能进行定量测定。其表达产物能进行定量测定。 药物化学复习24 报告基因的种类报告基因的种类 1、氯霉素乙酰转移酶、氯霉素乙酰转移酶 2、半乳糖苷酶、半乳糖苷酶 3、人生长激素、人生长激素 4、荧光素酶、荧光素酶 5、荧光蛋白、荧光蛋白 药物化学复习25 荧光产生的原因荧光产生的原因 原子荧光光谱原子荧光光谱的产生的产生 气态自由气态自由原子吸收原子吸收光源的特征辐射后，光源的特征辐射后， 原子的外层电子跃迁到较高能级，

26、然后又原子的外层电子跃迁到较高能级，然后又 跃迁返回基态或较低能级，同时发射出与跃迁返回基态或较低能级，同时发射出与 原激发波长相同或不同的发射即为原子荧原激发波长相同或不同的发射即为原子荧 光。原子荧光是光致发光，也是二次发光。光。原子荧光是光致发光，也是二次发光。 当激发光源停止照射之后，再发射过程立当激发光源停止照射之后，再发射过程立 即停止。即停止。 药物化学复习26 时间分辨荧光（时间分辨荧光（HTRF） 一般荧光技术的缺点是荧一般荧光技术的缺点是荧RF光寿命短，光寿命短， 背景荧光高，激发光和发射光容易相互背景荧光高，激发光和发射光容易相互 干扰干扰 HTRF主要是利用碱土金属寿命

27、长的特主要是利用碱土金属寿命长的特 点，可以在激发和检测之间延缓一段时点，可以在激发和检测之间延缓一段时 间，使具有不同荧光寿命的物质达到分间，使具有不同荧光寿命的物质达到分 别检测的目的。同时通过荧光谐振能量别检测的目的。同时通过荧光谐振能量 传递原理，区分开激发光和发射光传递原理，区分开激发光和发射光 药物化学复习27 荧光偏振（荧光偏振（FluorescencePolarization，FP） 1926年年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。以首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。以 一束单一波长的偏振光照射溶液中的荧光物质，后者可吸收并释放一束单一波长的偏

28、振光照射溶液中的荧光物质，后者可吸收并释放 出相应的偏振荧光。如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质出相应的偏振荧光。如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质 仍将保持原有激发光的偏振性，如果其处于运动状态，该物质发出仍将保持原有激发光的偏振性，如果其处于运动状态，该物质发出 的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性，也就是所谓荧光去偏振的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性，也就是所谓荧光去偏振 现象。当荧光染料被单极光激发释放荧光，产生水平和垂直方向光现象。当荧光染料被单极光激发释放荧光，产生水平和垂直方向光 束。水平和垂直方向光通量的比值即为偏振值（束。水平和垂直方向光通量的比值即为偏振值（

29、mP）。）。mP大小主大小主 要由荧光物质分子旋转速度决定，而旋转速度与分子大小呈反比。要由荧光物质分子旋转速度决定，而旋转速度与分子大小呈反比。 小分子荧光染料与其他分子结合后，分子量增加而旋转速度降低，小分子荧光染料与其他分子结合后，分子量增加而旋转速度降低， 则荧光偏振值（则荧光偏振值（Mp）升高；相反，如小分子荧光染料从已结合的分）升高；相反，如小分子荧光染料从已结合的分 子上解离，则荧光偏振值降低。由于子上解离，则荧光偏振值降低。由于FP直接检测水平和垂直方向光直接检测水平和垂直方向光 通量比值，通量比值，Mp值不受绝对荧光强度的影响，具有操作简单、快速；值不受绝对荧光强度的影响，具

30、有操作简单、快速； 分析结果稳定；成本低、高通量和易于自动化等优点。分析结果稳定；成本低、高通量和易于自动化等优点。 药物化学复习28 酶联免疫吸附酶联免疫吸附(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay,ELISA) 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体， 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留 酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的 抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与 固相载体表面的

31、抗原或抗体起反应。用洗涤的方固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方 法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物 质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中 受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物 后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标 本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应 的深浅进行定性或定量分析。的深浅进行定性或定量分析。 药物化学复习29 双抗体夹心双抗体夹心ELI

32、SA 1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除 去未结合的抗体及杂质。去未结合的抗体及杂质。 2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合， 形成固相抗原抗体复合物。形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。洗涤除去其他未结合物质。 3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶 标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体 上带有的酶量与标本中受检抗原的量

33、相关。上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过 比色，测知标本中抗原的量。比色，测知标本中抗原的量。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原。 药物化学复习30 竞争性竞争性ELISA 当抗原材料中的干扰物质不易除去，当抗原材料中的干扰物质不易除去， 或不易得到足够的纯化抗原时，可用此或不易得到足够的纯化抗原时，可用此 法检测特异性抗体。其原理为标本中的法检测特异性抗体。其原理为标本中的 抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗抗体和一

34、定量的酶标抗体竞争与固相抗 原结合。标本中抗体量越多，结合在固原结合。标本中抗体量越多，结合在固 相上的酶标抗体愈少，从而反映出抗体相上的酶标抗体愈少，从而反映出抗体 的量的量 药物化学复习31 PCR引物的设计原则总述 引物长度（引物长度（primerlength） 产物长度（产物长度（productlength） 序列序列Tm值值(meltingtemperature) G+C含量（含量（composition） 引物二聚体及发夹结构引物二聚体及发夹结构 （duplexformationandhairpin） 阅读框阅读框 药物化学复习32 中文名称：中文名称：质粒质粒 英文名称：英文名称

35、：plasmid 质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中，能独立于染色体质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中，能独立于染色体 DNA而自主复制的共价，闭合，环状而自主复制的共价，闭合，环状DNA分子，其大小分子，其大小 通常在通常在1-100kb范围内。质粒的复制和转录要依赖于宿主范围内。质粒的复制和转录要依赖于宿主 细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存 活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在 使宿主具有一些额外的特性使宿主具有一些额外的特性 药物化学复习33 具有对受体细胞的可移植性或

36、亲和性具有对受体细胞的可移植性或亲和性 具有与特定细胞相适应的复制位点和整合位点具有与特定细胞相适应的复制位点和整合位点 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有合适的选择性标记具有合适的选择性标记 药物化学复习34 药物化学复习35 肿瘤的发生不仅是分裂失控导致的细胞过度增生，同时也肿瘤的发生不仅是分裂失控导致的细胞过度增生，同时也 可能是细胞凋亡通路受阻，使本该死亡的细胞继续存在而可能是细胞凋亡通路受阻，使本该死亡的细胞继续存在而 产生肿瘤，因此，选择性诱导肿瘤细胞凋亡为目标的技术产生肿瘤，因此，选择性诱导肿瘤细胞凋亡为目标的技术 已成为肿瘤治疗的重要

37、策略之一。细胞凋亡是存在于细胞已成为肿瘤治疗的重要策略之一。细胞凋亡是存在于细胞 中的自毁机制，细胞凋亡能够使机体清除衰老和异常的细中的自毁机制，细胞凋亡能够使机体清除衰老和异常的细 胞，在维持许多细胞功能方面起到重要作用。胞，在维持许多细胞功能方面起到重要作用。 1972年年kerr等首先提出等首先提出“细胞凋亡细胞凋亡”这一概念，是由体内这一概念，是由体内 外因素触发的细胞内置的死亡程序诱导的细胞死亡过程。外因素触发的细胞内置的死亡程序诱导的细胞死亡过程。 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，自己结束其细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，自己结束其 生命的过程，具有严格的基因时控性

38、和选择性。生物体各生命的过程，具有严格的基因时控性和选择性。生物体各 种细胞的数量都是通过增殖与死亡之间的平衡来完成的。种细胞的数量都是通过增殖与死亡之间的平衡来完成的。 药物化学复习36 细胞周期 细胞周期细胞周期指由细胞分裂结束到下一指由细胞分裂结束到下一 次细胞分裂结束所经历的过程，所次细胞分裂结束所经历的过程，所 需的时间叫细胞周期时间。需的时间叫细胞周期时间。 G1期期(gap1)，指从有丝分裂完成，指从有丝分裂完成 到期到期DNA复制之前的间隙时间。复制之前的间隙时间。 S期期(synthesisphase)，指，指DNA复复 制的时期，只有在这一时期制的时期，只有在这一时期H3-

39、 TDR才能掺入新合成的才能掺入新合成的DNA中。中。 G2期期(gap2)，指，指DNA复制完成到复制完成到 有丝分裂开始之前的一段时间。有丝分裂开始之前的一段时间。 M期又称期又称D期期(mitosisordivision)， 细胞分裂开始到结束。细胞分裂开始到结束。 药物化学复习37 微管的功能 细胞内，微管以胞质微管和纺锤体微管两种形式存细胞内，微管以胞质微管和纺锤体微管两种形式存 在，主要参与细胞运动、细胞器的定位、胞内物质在，主要参与细胞运动、细胞器的定位、胞内物质 的运输及真核细胞的有丝分裂过程。的运输及真核细胞的有丝分裂过程。 细胞进入分裂期，其胞质微管解聚成微管蛋白后再细胞进

40、入分裂期，其胞质微管解聚成微管蛋白后再 组装成纺锤体微管。组装成纺锤体微管。 在分裂后期，纺锤体微管牵引着姊妹染色单体从赤在分裂后期，纺锤体微管牵引着姊妹染色单体从赤 道面移向纺锤体的两极。道面移向纺锤体的两极。 在有丝分裂结束后，纺锤体微管解聚再组装成胞质在有丝分裂结束后，纺锤体微管解聚再组装成胞质 微管。微管。 药物化学复习38 抗结核药物的筛选 药物化学复习39 What is 结核病? 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染 病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，病。结核菌可能侵入人体全身各种器官， 但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。但主要侵犯肺脏，称为肺结

41、核病。 是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传 染病。一年四季都可以发病，染病。一年四季都可以发病，15岁到岁到35岁岁 的青少年是结核病的高发峰年龄。潜伏期的青少年是结核病的高发峰年龄。潜伏期 48周。其中周。其中结核杆菌结核杆菌80发生在肺部，发生在肺部， 其他部位其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮 肤、骨骼肤、骨骼)也可继发感染。人与人之间呼也可继发感染。人与人之间呼 吸道传播是本病传染的主要方式。传染源吸道传播是本病传染的主要方式。传染源 是接触排菌的肺结核患者。是接触排菌的肺结核患者。 结核杆菌结核杆菌 药物化学复习40

42、当前抗结核治疗药物 临床常用治疗药物临床常用治疗药物 当常规治疗失败后可使用二线抗结核药物当常规治疗失败后可使用二线抗结核药物 临床常用治疗药物及耐药靶点临床常用治疗药物及耐药靶点 一线抗结核药物作用靶点的突变使原有药物一线抗结核药物作用靶点的突变使原有药物 的作用蛋白构像发生了改变的作用蛋白构像发生了改变 利福平，异烟肼，链霉素，乙胺丁醇和吡嗪酰胺利福平，异烟肼，链霉素，乙胺丁醇和吡嗪酰胺 这些药物不良反应多、杀菌作用不强、疗程必须使用这些药物不良反应多、杀菌作用不强、疗程必须使用 个月以上，患者依从性差。个月以上，患者依从性差。 卷曲霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、环丙沙卷曲霉素

43、、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、环丙沙 星、阿米卡星和卡那霉素星、阿米卡星和卡那霉素 不良反应较大，治疗时间更长（个月），花费昂不良反应较大，治疗时间更长（个月），花费昂 贵，治愈率也更低贵，治愈率也更低 年我国总耐药率为，其中年我国总耐药率为，其中 初始耐药率为初始耐药率为.，获得性耐药率为，获得性耐药率为. 药物化学复习41 抗结核药物新靶点 与胞壁合成相关的新靶点与胞壁合成相关的新靶点 与持留态有关的新靶点与持留态有关的新靶点 与结核杆菌毒性相关的靶点与结核杆菌毒性相关的靶点 与核酸相关的靶点与核酸相关的靶点 药物化学复习42 与胞壁合成相关的新靶点- 肌醇-1-磷酸合成酶 肌醇存

44、在于分枝杆菌中肌醇存在于分枝杆菌中,与其生长繁殖密切相关。与其生长繁殖密切相关。 肌醇是合成细胞壁的必须前体肌醇是合成细胞壁的必须前体 结核杆菌利用肌醇合成其体内主要的硫醇结核杆菌利用肌醇合成其体内主要的硫醇分枝硫醇。分枝硫醇在分枝硫醇。分枝硫醇在 维持分枝杆菌的氧化还原平衡、保护细胞免受氧化应激的伤害和半胱维持分枝杆菌的氧化还原平衡、保护细胞免受氧化应激的伤害和半胱 氨酸的保存方面起着重要的作用氨酸的保存方面起着重要的作用,对细菌的生长和毒力具有重要意义。对细菌的生长和毒力具有重要意义。 肌醇在细菌体内合成的第一步是葡萄糖肌醇在细菌体内合成的第一步是葡萄糖-6-磷酸在肌醇磷酸在肌醇-1-磷酸

45、合成酶磷酸合成酶 (ino1,酶编号酶编号5.5.1.4)的催化下形成肌醇的催化下形成肌醇-1-磷酸。肌醇磷酸。肌醇-1-磷酸合成酶磷酸合成酶 基因突变的结核杆菌，在正常的培养基上无法生长。基因突变的结核杆菌，在正常的培养基上无法生长。 药物化学复习43 肌醇-1-磷酸合成酶 故肌醇故肌醇-1-磷酸合成酶可以作为抗结核药物的靶位，而由此产生的药物磷酸合成酶可以作为抗结核药物的靶位，而由此产生的药物 可能对结核杆菌具有较强的特异性。可能对结核杆菌具有较强的特异性。 肌醇肌醇-1-磷酸合成酶也是真核生物中非常重要的多元醇。在设计和筛选磷酸合成酶也是真核生物中非常重要的多元醇。在设计和筛选 结核杆菌

46、肌醇结核杆菌肌醇-1-磷酸合成酶抑制剂的时候，应尽量避免抑制剂对真核磷酸合成酶抑制剂的时候，应尽量避免抑制剂对真核 生物的肌醇生物的肌醇-1-磷酸合成酶产生抑制作用，影响人体的正常生理功能，磷酸合成酶产生抑制作用，影响人体的正常生理功能， 从而产生药物副作用。从而产生药物副作用。 药物化学复习44 磷酸肌醇合成酶抑制剂磷酸肌醇合成酶抑制剂 在在37摄氏度下，摄氏度下，0.5mM2-3H肌醇肌醇(12,000cpm/nmol)(用用 3H标记标记)用用CHCl3作溶剂，同时加入作溶剂，同时加入Tris-HC1(pH8.3) 48mMMgCl2,0.5mMPtd-CMP,0.25%聚乙二醇辛基苯聚

47、乙二醇辛基苯 基醚基醚(TritonX-100),5mM类似物类似物,和和0.05mg的的微粒体蛋微粒体蛋 白，配置成白，配置成0.1mL的溶液。反应的溶液。反应20分钟后加入分钟后加入0.5 mL的的 0.1NHCl（含有（含有MeOH)和和0.5mLofCHCl3。用。用0.5mL的的 水分离。水分离。 有机质层的放射性用闪烁探测器来测定。有机质层的放射性用闪烁探测器来测定。 药物化学复习45 肌醇抑制剂放入肌醇抑制剂放入F111细胞细胞 将将F111细胞放入培养皿中培养一晚上，培养皿中加入细胞放入培养皿中培养一晚上，培养皿中加入10%经透析的胎经透析的胎 牛血清和牛血清和10微克的肌醇。

48、附着在玻盖上的细胞用微克的肌醇。附着在玻盖上的细胞用Krebs-Ringer缓冲液缓冲液 (135mMNaC1,4.6mMKC1,1.2mMCaCl2,lmM磷酸钠磷酸钠,1.3mM MgSO4,5mMHEPESpH7.41）冲洗两次，然后浸在含有）冲洗两次，然后浸在含有10pM3H】 肌醇肌醇(l000cpm/pmol)和和5mM类似物中，放入含有类似物中，放入含有5%CO2的恒温箱的恒温箱 恒温在恒温在37摄氏度。摄氏度。 120分钟后将细胞用分钟后将细胞用140mMNaCl冲洗六次，一份溶解在冲洗六次，一份溶解在1%SDS中，中， 另一份溶解在另一份溶解在10%三氯乙酸中，然后离心分离。

49、三氯乙酸中，然后离心分离。 最后细胞溶解液在闪烁探测器中测定放射性，用蛋白浓度测定试剂盒最后细胞溶解液在闪烁探测器中测定放射性，用蛋白浓度测定试剂盒 测定蛋白质。测定蛋白质。 药物化学复习46 与毒性有关的靶点与毒性有关的靶点-泛酸合成酶泛酸合成酶 泛酸是一种泛酸是一种B族维生素族维生素(Vit&)，它是辅酶，它是辅酶A(CoA)和酰基载体和酰基载体 蛋白蛋白(ACP)的生物合成的关键前体，的生物合成的关键前体，CoA和和ACP分子结构中分子结构中 的磷酸泛酰巯基乙胺来源于泛酸；的磷酸泛酰巯基乙胺来源于泛酸；CoA和和ACP参与生物体内参与生物体内 碳水化合物、脂肪酸、蛋白质和能量代谢，是细胞

50、生长过程碳水化合物、脂肪酸、蛋白质和能量代谢，是细胞生长过程 中重要的辅因子；阻断泛酸的合成将抑制结核杆菌的生长。中重要的辅因子；阻断泛酸的合成将抑制结核杆菌的生长。 此外，泛酸的生物合成对于结核杆菌的毒性也是至关重要的，此外，泛酸的生物合成对于结核杆菌的毒性也是至关重要的， 敲除泛酸合成酶基因敲除泛酸合成酶基因panC和和panD所得的泛酸营养缺陷型菌株所得的泛酸营养缺陷型菌株 毒性比卡介苗还低。并且，微生物和植物都必须通过自身生毒性比卡介苗还低。并且，微生物和植物都必须通过自身生 物途径合成泛酸，而哺乳动物自身不能合成泛酸，必须从食物途径合成泛酸，而哺乳动物自身不能合成泛酸，必须从食 物中

51、获得。因此，泛酸合成途径是一个理想的抗结核药物作物中获得。因此，泛酸合成途径是一个理想的抗结核药物作 用靶点用靶点。 药物化学复习47 结核杆菌泛酸合成途径中，主要有结核杆菌泛酸合成途径中，主要有4个酶参与反应，酮泛个酶参与反应，酮泛 解酸羟甲基转移酶解酸羟甲基转移酶(PanB),泛酸合成酶泛酸合成酶(PanC)L-天冬氨酸天冬氨酸- -脱羧酶脱羧酶(PanD)和酮泛解酸还原酶和酮泛解酸还原酶(PanE),四种酶协同催化四种酶协同催化 下完成的。它们分别由下完成的。它们分别由panB、panC、panD和和panE编码。编码。 这其中泛酸合成酶这其中泛酸合成酶(pantothenatesynt

52、hetase，IX3)是关键是关键 的限速酶，催化泛酸合成的最后一步反应，因此，泛酸合的限速酶，催化泛酸合成的最后一步反应，因此，泛酸合 成酶成为抗结核药物合适靶位。成酶成为抗结核药物合适靶位。 药物化学复习48 筛选方法筛选方法 建立泛酸合成酶活力的测定方法：原理是泛建立泛酸合成酶活力的测定方法：原理是泛 酸合成酶催化反应得到的产物之一为酸合成酶催化反应得到的产物之一为 AMP,AMP可反应得到可反应得到ADP,ADP和磷酸烯和磷酸烯 醇式丙酮酸钾作用生成丙酮酸，丙酮酸生醇式丙酮酸钾作用生成丙酮酸，丙酮酸生 成乳酸消耗成乳酸消耗NADH,还原态的还原态的NADH在在 340nm有吸光，而氧化

53、态的没有。由分光有吸光，而氧化态的没有。由分光 光度计测吸光度的变化，从而测定泛酸合光度计测吸光度的变化，从而测定泛酸合 成酶活性。成酶活性。 药物化学复习49 与核酸相关的靶点与核酸相关的靶点 DNA回旋酶回旋酶 DNA回旋酶，又称促旋酶，旋转酶。属拓扑异构酶回旋酶，又称促旋酶，旋转酶。属拓扑异构酶II(type II），它的作用是在水解），它的作用是在水解ATP的同时能使松弛态环状的同时能使松弛态环状DNA 转变为负超螺旋转变为负超螺旋DNA,与细菌体内与细菌体内DNA转录复制重组和修转录复制重组和修 复等生理过程密切相关。复等生理过程密切相关。 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶（DNAtopo

54、isomerase）为催化）为催化DNA拓扑拓扑 学异构体相互转变的酶之总称。催化学异构体相互转变的酶之总称。催化DNA链断开和结合的链断开和结合的 偶联反应，为了分析体外反应机制，用环状偶联反应，为了分析体外反应机制，用环状DNA为底物。为底物。 在闭环状双链在闭环状双链DNA的拓扑学转变中，要暂时的将的拓扑学转变中，要暂时的将DNA的的 一个链或两个链切断，根据异构体化的方式而分为二个型。一个链或两个链切断，根据异构体化的方式而分为二个型。 切断一个链而改变拓扑结构的称为切断一个链而改变拓扑结构的称为型拓扑异构酶（型拓扑异构酶（top- oisomerase），通过切断二个链来进行的称为）

55、，通过切断二个链来进行的称为型拓扑型拓扑 异构酶（异构酶（topoisomerase）。）。 药物化学复习50 超螺旋是超螺旋是DNA三级结构三级结构 DNA在二级结构双螺旋的基础上，进一步扭曲、折叠，螺旋形成超螺在二级结构双螺旋的基础上，进一步扭曲、折叠，螺旋形成超螺 旋的三级结构。螺旋变紧的称为正超螺旋，变松的称为负超螺旋。这旋的三级结构。螺旋变紧的称为正超螺旋，变松的称为负超螺旋。这 是是DNA三级结构的一种常见形式。三级结构的一种常见形式。 药物化学复习51 酶活性测定酶活性测定 在缓冲液中，加入超螺旋在缓冲液中，加入超螺旋PcDNA质粒及回旋酶酶提液和质粒及回旋酶酶提液和 不同浓度的

56、药物不同浓度的药物(设空白对照组及加酶不加药对照组设空白对照组及加酶不加药对照组)，混，混 匀后，匀后，37温孵温孵30min。加入及蛋白酶。加入及蛋白酶K。中止反应；继。中止反应；继 续于续于37温孵温孵30min后，加入溴酚蓝；点样于后，加入溴酚蓝；点样于08琼脂琼脂 糖凝胶板，在糖凝胶板，在70V电压下电泳电压下电泳1h，以溴化乙啶，以溴化乙啶(EB)溶液溶液 染色至少染色至少30min，置凝胶成像系统中观察结果并照像记录。，置凝胶成像系统中观察结果并照像记录。 药物化学复习52 以异柠檬酸裂解酶（以异柠檬酸裂解酶（ICL）为靶点）为靶点 异柠檬酸裂解酶（异柠檬酸裂解酶（isocitra

57、telyase，ICL）是乙醛）是乙醛 酸循环途径中的关键限速酶之一，研究表明异柠檬酸裂解酸循环途径中的关键限速酶之一，研究表明异柠檬酸裂解 酶对于持留结合杆菌的存活起关键作用，决定了结核杆菌酶对于持留结合杆菌的存活起关键作用，决定了结核杆菌 的的持留持留性，最终导致结核病疗程过长。敲除了性，最终导致结核病疗程过长。敲除了ICL基因的基因的 结核分支杆菌不再具有持留性。而人等高等动物中不存在结核分支杆菌不再具有持留性。而人等高等动物中不存在 乙醛酸代谢途径。乙醛酸代谢途径。 药物化学复习53 筛选模型的建立筛选模型的建立 以以D（s）型异柠檬酸作为底物，利用）型异柠檬酸作为底物，利用ICL参与

58、的酶促反应参与的酶促反应 产物（乙醛酸和苯腙反应后的复合物）在产物（乙醛酸和苯腙反应后的复合物）在324nm处有吸收处有吸收 的特性，测定的特性，测定25酶促反应体系在酶促反应体系在324nm处吸光度的变化，处吸光度的变化， 即可测得异柠檬酸裂解酶的活力。即可测得异柠檬酸裂解酶的活力。 异柠檬酸裂解酶可催化底物异柠檬酸产生琥珀酸和乙醛酸，异柠檬酸裂解酶可催化底物异柠檬酸产生琥珀酸和乙醛酸， 产物乙醛酸可与苯肼反应生成苯腙，苯腙在产物乙醛酸可与苯肼反应生成苯腙，苯腙在324nm波长下波长下 产生光吸收峰，因此测定酶促反应体系在产生光吸收峰，因此测定酶促反应体系在324nm波长下光波长下光 吸收的

59、变化即可测定异柠檬酸裂解酶的酶活力。吸收的变化即可测定异柠檬酸裂解酶的酶活力。 药物化学复习54 以蛋白激酶以蛋白激酶G为靶点的筛选为靶点的筛选 研究表明，结核分枝杆菌（研究表明，结核分枝杆菌（MTB）自身基因组内）自身基因组内 的的pknG基因所编码的蛋白激酶基因所编码的蛋白激酶G（PknG）对持留状态的）对持留状态的 形成起着关键性的作用。当形成起着关键性的作用。当MTB被巨噬细胞吞噬，形成被巨噬细胞吞噬，形成 吞噬体厚，吞噬体厚，PknG可以阻止吞噬体与细胞内溶酶体的融合，可以阻止吞噬体与细胞内溶酶体的融合， 从而使从而使MTB在细胞内免于被溶酶体的水解酶类降解。在细胞内免于被溶酶体的水

60、解酶类降解。 药物化学复习55 药物化学复习56 -糖尿病治疗的作用靶点糖尿病治疗的作用靶点 药物化学复习57 1.定义：定义：糖尿病是一组由于糖尿病是一组由于胰岛胰岛 素素分泌缺陷及（或）其生物学分泌缺陷及（或）其生物学 作用障碍引起的作用障碍引起的高血糖高血糖为特征为特征 的某些疾病。慢性高血糖常导的某些疾病。慢性高血糖常导 致各种脏器，尤其是眼、肾、致各种脏器，尤其是眼、肾、 神经及心血管的长期损害、功神经及心血管的长期损害、功 能不全和衰竭能不全和衰竭 2.分类：分类： 1型型（B细胞被破坏，常导致胰细胞被破坏，常导致胰 岛素绝对缺乏）岛素绝对缺乏） 2型型（胰岛素抵抗或分泌缺陷）（胰