酶工程基本原理课件

1、酶工程基本原理1 酶工程酶工程 主要参考书主要参考书: : 1 1 酶工程，郭酶工程，郭 勇勇 主编，高等学校轻工专业试用教材，中国轻主编，高等学校轻工专业试用教材，中国轻 工业出版社；工业出版社； 2 2 酶工程，罗贵酶工程，罗贵 主编，化学工业出版社；主编，化学工业出版社； 3 3 蛋白质分子结构，阎隆飞主编，清华大学出版社；蛋白质分子结构，阎隆飞主编，清华大学出版社； 4 4 应用酶学导论，禹邦超编著，应用酶学导论，禹邦超编著， 华中师范大学出版社；华中师范大学出版社； 5 5 酶学，酶学， 邹国林主编，武汉大学出版社；邹国林主编，武汉大学出版社； 6 6 酶在食品加工中的应用，酶在食品

2、加工中的应用， EE李雁群译，李雁群译，中国轻工业出版社；中国轻工业出版社； 酶工程基本原理2 CH 1 绪绪 论论 CH 1.1 酶的基本概念酶的基本概念 1 酶是蛋白质酶是蛋白质 2 酶具有催化活性酶具有催化活性 3 酶催化反应具有专一性和高效性酶催化反应具有专一性和高效性 CH 1.2 酶工程及其主要研究内容酶工程及其主要研究内容 CH 1.3 酶的历史沿革酶的历史沿革 酶工程基本原理3 酶的特性 n一一.酶与一般催化剂的共性酶与一般催化剂的共性 1.用量少，催化效率高 2.不改变化学反应的平衡点 3.可降低反应的活化能 n二二 .酶与一般催化剂的区别酶与一般催化剂的区别酶的特性酶的特性

3、 1.高效性 2.专一性 结构专一性（相对专一性/绝对专一性） （特异性 ）立体异构专一性(几何异构/旋光异构) 3.不稳定性（要求温和的反应条件） 4.可调控性 酶工程基本原理4 CH 1.1 酶的基本概念酶的基本概念 1 酶是蛋白质酶是蛋白质 酶的化学本质是蛋白质，这一点是被生物化学所酶的化学本质是蛋白质，这一点是被生物化学所 证明了的，研究酶的化学本质，可用研究蛋白质的方证明了的，研究酶的化学本质，可用研究蛋白质的方 法进行研究；法进行研究； 一般情况下，一个结构完整的酶包括蛋白质和非一般情况下，一个结构完整的酶包括蛋白质和非 蛋白质两部分，蛋白质部分称为辅基酶蛋白，非蛋白蛋白质两部分，

4、蛋白质部分称为辅基酶蛋白，非蛋白 质部分称为辅助因子，辅基酶蛋白和辅助因子构成一质部分称为辅助因子，辅基酶蛋白和辅助因子构成一 个全酶。辅助因子的化学本质因不同的酶而不同，它个全酶。辅助因子的化学本质因不同的酶而不同，它 可以是小分子量的有机化合物，也可以是无机矿物质可以是小分子量的有机化合物，也可以是无机矿物质 离子。离子。 酶工程基本原理5 n2 酶具有催化活性酶具有催化活性 n酶是一种生物催化剂，在催化活性上与无机催化酶是一种生物催化剂，在催化活性上与无机催化 剂类似，酶在催化反应时，其本身不发生化学改变，剂类似，酶在催化反应时，其本身不发生化学改变， 只是催化反应的进行，此外，酶在催化

5、反应时，仅改只是催化反应的进行，此外，酶在催化反应时，仅改 变反应速度，并不改变反应的平衡。酶催化反应的动变反应速度，并不改变反应的平衡。酶催化反应的动 力学机理是降低反应的活化能。力学机理是降低反应的活化能。 n酶与一般催化剂的共性酶与一般催化剂的共性 n 1.用量少，催化效率高 n 2.不改变化学反应的平衡点 n 3.可降低反应的活化能 酶工程基本原理6 例如：例如：乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase EC 1.1.1.27)催化丙酮催化丙酮 酸生成酸生成L-乳酸而乳酸而D乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.28)却只能催化催化丙却只能催化催化丙 酮酸生成

6、酮酸生成D-乳酸乳酸 CH 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 CH C =O HCOH COOH NADH NAD+ COOH CH D乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 CH C =O HOCH COOH NADH NAD+ COOH 酶工程基本原理7 n3 酶催化反应具有专一性和高效性酶催化反应具有专一性和高效性 n酶作为生物催化剂，其催化反应的专一性远远超过无机催化酶作为生物催化剂，其催化反应的专一性远远超过无机催化 剂，根据酶的专一化程度，可分为绝对专一性和相对专一性。剂，根据酶的专一化程度，可分为绝对专一性和相对专一性。 n绝对专一性是指一种酶只能催化一种底物进行一种反应，底绝对专一性是指一种酶只能催化一种底

7、物进行一种反应，底 物的分子结构、空间构型及构象的不同都表现出专一性。物的分子结构、空间构型及构象的不同都表现出专一性。 n酶与一般催化剂的区别酶与一般催化剂的区别酶的特性酶的特性 n 1.高效性 n 2.专一性 结构专一性（相对专一性/绝对专一性） n （特异性 ）立体异构专一性(几何异构/旋光异构) n 3.不稳定性（要求温和的反应条件） n 4.可调控性 酶工程基本原理8 n 相对专一性是指一种能够催化一类结构相对专一性是指一种能够催化一类结构 相似的物质进行相同类型的反应，主要是对某相似的物质进行相同类型的反应，主要是对某 一化学键的专一性。一化学键的专一性。 n 例如：胰蛋白酶例如：

8、胰蛋白酶 (Trypsin EC 3.4.31.4) 催催 化含有赖氨酸或精氨酸羰基的肽键的水解反应，化含有赖氨酸或精氨酸羰基的肽键的水解反应， 凡是具有含赖氨酸或精氨酸羰基酰胺键的底物凡是具有含赖氨酸或精氨酸羰基酰胺键的底物 都能被此酶催化水解。都能被此酶催化水解。 酶工程基本原理9 CH 1.2 酶工程及其主要研究内容酶工程及其主要研究内容 1 生物工程（生物工程（Biotechnology）：）：又叫生物工艺学，是又叫生物工艺学，是20世纪世纪70年代年代 开始提出的一个高新技术名词，是指以遗传工程技术为先导的将开始提出的一个高新技术名词，是指以遗传工程技术为先导的将 生物技术与化学工艺

9、、工程相结合并产业化应用的技术领域。包生物技术与化学工艺、工程相结合并产业化应用的技术领域。包 括四大分支领域：遗传工程、细胞工程、发酵工程和酶工程。括四大分支领域：遗传工程、细胞工程、发酵工程和酶工程。 2 酶工程（酶工程（Enzyme Engineering）：）：是酶学研究与其应用工程结合是酶学研究与其应用工程结合 形成的一门新的技术领域；是酶学、微生物学的基本原理与化学形成的一门新的技术领域；是酶学、微生物学的基本原理与化学 工程技术有机结合、相互渗透形成的边缘学科。工程技术有机结合、相互渗透形成的边缘学科。 包括上游工程和下游工程：前者包括酶的产生和酶制剂制备；后包括上游工程和下游工

10、程：前者包括酶的产生和酶制剂制备；后 者主要包括酶固定化技术、酶修饰技术和生物反应器。者主要包括酶固定化技术、酶修饰技术和生物反应器。 （1）上游技术：）上游技术： （2）下游技术：）下游技术： 酶工程基本原理10 CH 1.3 酶的历史沿革酶的历史沿革 1 酶学研究简史酶学研究简史 1 酶的发现酶的发现: 尽管我国早在尽管我国早在4000多年前就朴素地应用了酶多年前就朴素地应用了酶, 但真正对但真正对 酶的认识还是酶的认识还是1833年年Payen 和和 Person 首先从酒精发酵物中提取首先从酒精发酵物中提取 到一种活性物质到一种活性物质, 发现能够促进淀粉分解发现能够促进淀粉分解(发现

11、了淀粉酶发现了淀粉酶); 2 酶酶(Enzyme)的提出的提出: 继继Payen 和和Person之后之后, 德国的德国的Kuhne进一进一 步深入研究了酶步深入研究了酶,并提出并提出Enzyme这个名词这个名词; enzyme 是希腊文是希腊文,原原 意是指意是指“在酵母中在酵母中” 我们翻译成我们翻译成酶酶, 日本译成日本译成酵素酵素. 3 酶学酶学(Enzymology)奠基奠基:在在Kuhne 之后之后, Buchner兄弟从事了从兄弟从事了从 破碎酵母细胞提取酶的研究破碎酵母细胞提取酶的研究, 获得了能转化糖产生乙醇的粗酶获得了能转化糖产生乙醇的粗酶. 此此 后便开始了从酶的提取、酶

12、的性质、酶催化反应等开始了酶的研后便开始了从酶的提取、酶的性质、酶催化反应等开始了酶的研 究。形成了初步的新兴学科。究。形成了初步的新兴学科。 酶工程基本原理11 n在酶催化理论方面：在酶催化理论方面： n1 1894年，年，E.Fisher提出酶与底物作用的锁钥学说提出酶与底物作用的锁钥学说 n2 1913 年，年，Michaelis Menton提出了快速平衡学提出了快速平衡学 说，说， n 建立了建立了AN酶促反应模型，酶促反应模型， 推导出了酶促反应动推导出了酶促反应动 力学力学 n 方程方程米氏方程。米氏方程。 n3 1925年，年，Briggs和和Handane ，建立了恒态学说，

13、建立了恒态学说， 并并 n 对米氏方程的修正。对米氏方程的修正。 n4 1958年，年，Koshland提出了诱导契合学说提出了诱导契合学说 酶工程基本原理12 n在酶蛋白化学的研究方面在酶蛋白化学的研究方面 n1 1926年，年，Sumner首次获得了脲酶结晶，证实了酶的首次获得了脲酶结晶，证实了酶的 n 化学本质是蛋白质化学本质是蛋白质21年后获得了诺贝尔奖。年后获得了诺贝尔奖。 n2 1963年搞清了牛胰核糖核酸酶年搞清了牛胰核糖核酸酶A的一级结构；的一级结构； n3 1965年报道了鸡卵清溶菌酶的三维结构；年报道了鸡卵清溶菌酶的三维结构； n4 1969年首次利用单一氨基酸人工合成核糖

14、核酸酶获年首次利用单一氨基酸人工合成核糖核酸酶获 n 得成功得成功 n5 1982年年Cech小组发现了小组发现了rRNA具有催化功能，第一具有催化功能，第一 n 次动摇了酶是蛋白质的概念。（次动摇了酶是蛋白质的概念。（Ribozyme） n 但蛋白质化学研究与其催化原理及其酶蛋白功能研究始终是但蛋白质化学研究与其催化原理及其酶蛋白功能研究始终是 互相促进、相互渗透的。互相促进、相互渗透的。 酶工程基本原理13 CH 1.3 酶的历史沿革酶的历史沿革 2 酶工程的发展历程酶工程的发展历程 1 酶工程研究的奠基：以工业化酶制剂生产为主要内容的酶工程雏酶工程研究的奠基：以工业化酶制剂生产为主要内容

15、的酶工程雏 形阶段（形阶段（50年代）；年代）； 2 酶固定化技术和细胞固定化技术研究始于酶固定化技术和细胞固定化技术研究始于60年代；年代； 3 70年代基因工程崛起，将酶工程技术研究引向深入并赋予了新的年代基因工程崛起，将酶工程技术研究引向深入并赋予了新的 内涵；内涵； 4 1971年第一次国际酶工程会议的召开，标志了酶工程学科和完善年第一次国际酶工程会议的召开，标志了酶工程学科和完善 的技术体系的形成；的技术体系的形成； 5 80年代实现了克隆酶的突破；（年代实现了克隆酶的突破；（Wager将青霉素酰化酶基因克隆将青霉素酰化酶基因克隆 到到Ecoli菌株菌株 质粒上，获得了高效表达）质粒

16、上，获得了高效表达） 6 80年代形成了酶固定化技术、细胞固定化技术研究等酶工程的研年代形成了酶固定化技术、细胞固定化技术研究等酶工程的研 究热点，并广泛产业化应用究热点，并广泛产业化应用. 开始了转基因技术和酶化学修饰技术；开始了转基因技术和酶化学修饰技术； 7 90年代形成了以遗传工程为先导的酶工程技术分支年代形成了以遗传工程为先导的酶工程技术分支生物酶工生物酶工 程（包括酶基因克隆表达和基因修饰）程（包括酶基因克隆表达和基因修饰） 酶工程基本原理14 CH 1.1 酶的结构和功能酶的结构和功能 CH 1.2 酶催化反应的动力学酶催化反应的动力学 CH 1.3 酶的分类和命名酶的分类和命名

17、 CH 1.4 酶活力概念及活力测定酶活力概念及活力测定 CH 2 酶学基本原理酶学基本原理 酶工程基本原理15 CH 2.1 酶的结构和功能酶的结构和功能 ( . 酶催化功能的结构基础酶催化功能的结构基础 ) 1.1 酶的活性中心酶的活性中心 构成酶活性中心的氨基酸在一级结构上构成酶活性中心的氨基酸在一级结构上, 呈分散状态，呈分散状态， 这些氨基酸是通过酶蛋白的二、三、四级结构使得其这些氨基酸是通过酶蛋白的二、三、四级结构使得其 在空间上彼此集中，构成一个特定的与酶活性表达有在空间上彼此集中，构成一个特定的与酶活性表达有 关区域，这个特定区域即酶的活性中心关区域，这个特定区域即酶的活性中心

18、(active center)， 换句话说，换句话说，酶的活性中心是酶分子上的与底物结合并酶的活性中心是酶分子上的与底物结合并 催化反应的特定基团或特定区域。催化反应的特定基团或特定区域。 酶活性中心包括两部分，其一是底物结合部位，其酶活性中心包括两部分，其一是底物结合部位，其 二是催化部位。二是催化部位。 例如溶菌酶例如溶菌酶:由由129个个AA构成构成, 而构成活性中心的而构成活性中心的AA 有有:Glu35, Asp52, Try62, Asp101(Gly101) 构成构成. 酶工程基本原理16 n1.2酶作用高效性机理酶作用高效性机理 n -影响酶高效性的因素影响酶高效性的因素 n

19、1.邻近定向效应 2.应变效应 n 3.亲核催化/亲电催化（共价催化） n 4.酸碱催化 5.微环境的影响 n 邻近效应邻近效应 是指是指A和和B两个底物分子结合在酶分子的结合部位上，两个底物分子结合在酶分子的结合部位上， 两分子的反应基团相互靠近，从而降低了两分子进入过渡态所需两分子的反应基团相互靠近，从而降低了两分子进入过渡态所需 要的能量，或说增加了两分子反应基团的发生反应的空间机率。要的能量，或说增加了两分子反应基团的发生反应的空间机率。 n 定向效应定向效应 A、B两个分子进入过渡态，两分子的反应基团需要两个分子进入过渡态，两分子的反应基团需要 按一定的方向重叠或交叉，这一方向稍有偏

20、离，反应就难以进行按一定的方向重叠或交叉，这一方向稍有偏离，反应就难以进行 或增加很大能量才能进行，这种酶活性部位赋予底物的这一方向或增加很大能量才能进行，这种酶活性部位赋予底物的这一方向 性即定向效应。性即定向效应。 酶工程基本原理17 n1.3 别构酶别构酶 n 酶分子表现其活性是以完整的结构为基础的，酶分子表现其活性是以完整的结构为基础的， 某些酶除其活性部位外，还有一个别构部位影某些酶除其活性部位外，还有一个别构部位影 响酶的活性，这些酶又称为别构酶或变构酶。响酶的活性，这些酶又称为别构酶或变构酶。 n 别构酶多为代谢别构酶多为代谢 代谢调节酶，由别构部位代谢调节酶，由别构部位 的变构

21、改变酶的活性，别构部位的变构也是通的变构改变酶的活性，别构部位的变构也是通 过与一个配体结合来实现的，但其与酶的活性过与一个配体结合来实现的，但其与酶的活性 部位不同，别构部位结合的配体不是底物，而部位不同，别构部位结合的配体不是底物，而 是一个调节酶活性的效应物。是一个调节酶活性的效应物。 酶工程基本原理18 酶工程基本原理19 CH 2.1 酶的结构和功能酶的结构和功能 ( 2 2. 酶催化专一性基本学说酶催化专一性基本学说 ) 2.1 锁钥学说锁钥学说(lock and key theory) 1894年，年，E.Fisher提出酶与底物作用的锁钥学说，以提出酶与底物作用的锁钥学说，以

22、解释酶与底物之间的专一性问题，其基本含义是：酶与解释酶与底物之间的专一性问题，其基本含义是：酶与 底物分子或底物分子的一部分之间，在结构上有严格的底物分子或底物分子的一部分之间，在结构上有严格的 互补对应关系，当底物与酶结合时就象钥匙和锁那样契互补对应关系，当底物与酶结合时就象钥匙和锁那样契 合对应。合对应。 .2 诱导契合学说诱导契合学说(induced-fit hypothesis) 1958年，年，Koshland提出了诱导契合学说，其主要内涵提出了诱导契合学说，其主要内涵 是：当酶与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导是：当酶与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导 ，其构象发生有利

23、于与底物分子结合或催化的变化，酶，其构象发生有利于与底物分子结合或催化的变化，酶 与底物在此基础上互补契合，以发挥酶的催化功能。与底物在此基础上互补契合，以发挥酶的催化功能。 酶工程基本原理20 锁锁 钥钥 学学 说说 酶工程基本原理21 诱导契合学说 酶工程基本原理22 丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹 陷的小口袋中，陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋内的微环口袋的大小以及口袋内的微环 境（疏水性、电荷性质）决定了境（疏水性、电荷性质）决定了丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶 的底物专一性的底物专一性 酶工程基本原理23 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 ： 口袋较大

24、，主要由疏水氨基酸残基围成，开口较大（由两 个Gly组成），因此需要底物有一个疏水基团（芳香环Phe、 Tyr、Trp及大的非极性侧链）定位。裂解芳香族氨基酸羧 基侧的肽键 胰蛋白酶：胰蛋白酶： 口袋较大，底部有Asp，利于Lys.、Arg结合，裂解碱性氨 基酸残基羧基侧的肽键 弹性蛋白酶：弹性蛋白酶： 口袋较浅，开口较小（由Val，Thr组成）只能让Ala等小 分进入，裂解小的中性氨基酸残基羧基侧的肽键 酶工程基本原理24 酶工程基本原理25 酶催化机理实例酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser -His-Asp催化 三联体（电荷中继网）。 电荷中继网： S

25、er195His57Asp102氢键体系。 通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。 没有底物时， Ser195His57Asp102形成一个氢 键体系，His57是去质子化状态， Asp102的 COO-通过氢键定位并固定His57。 结合底物时： His57从Ser195接受一个质子，增加 了Ser195羟基氧原子对底物的亲核攻击性， Asp102的COO-稳定过度态中His57的正电荷形式。 酶工程基本原理26 胰凝乳蛋白酶反应的详细机制 第一阶段： 酰化 Ser195-OH 中的氧攻击肽键的羰基碳（共价催 化），酶的His57咪唑H+与底物中的-NH形成氢 键 （ 酸 碱 催 化 ） ，

26、 形 成 四 联 体 过 渡 态 （Ser195O-、底物的羰基C、底物的-NH、 His的咪唑H+ ），肽键断裂，氨基产物释放，底 物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。 第二阶段： 脱酰 电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH- 攻击连在Ser195上底物的羰基C原子，形成四联 体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上 的氧原子，底物中的酸成分从Ser195上释放。 酶工程基本原理27 酶催化机理实例酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 1.胰凝乳蛋白酶结构胰凝乳蛋白酶结构 酶工程基本原理28 酶催化机理实例酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 2.胰凝乳蛋白酶的电

27、荷接力网胰凝乳蛋白酶的电荷接力网 酶工程基本原理29 四四.酶催化机理实例酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 2. 胰凝乳蛋白酶的催化过程胰凝乳蛋白酶的催化过程 A.酶与底物结合，形成米氏复合物（ES）B.形成四联体过度态中间物 酶工程基本原理30 酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶 酶工程基本原理31 酶催化机理实例酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 E.形成包括水分子的四联体过度中间物 F.羰基产物形成，酶游离 酶工程基本原理32 CH2.2 酶催化反应的动力学酶催化反应的动力学 （. 酶催化反应的初速度）酶催化反应的初速度） 酶催化反应模型酶催化反应模型 S P ds dp V= = d

28、t dt 酶促反应进行时间酶促反应进行时间/min 产物生成量产物生成量/微摩微摩 P K 酶工程基本原理33 2.1 Michaelis-Menten迅速平衡学说迅速平衡学说 及及Henri-Michaelis-Mentwen方程方程 单底物酶促反应模型单底物酶促反应模型: k1kp E+SESE+P -k1 迅速平衡学说对上述反应模型有两点假定：迅速平衡学说对上述反应模型有两点假定： 酶与底物结合形成酶底物复合物的速度很快。酶与底物结合形成酶底物复合物的速度很快。 整个反应速度取决于酶底物复合物释放出游离酶和形成产整个反应速度取决于酶底物复合物释放出游离酶和形成产 物的反应速度。物的反应速

29、度。 CH2.2 酶催化反应的动力学酶催化反应的动力学 （2.底物浓度对反应速度的影响）底物浓度对反应速度的影响） 酶工程基本原理34 反应速度反应速度 v=kpES.(1) Ks=ES/ES (Ks是是ES的分解常数的分解常数).(2) ES=ES/Ks.(3) 如果我们设反应体系中酶的总浓度为如果我们设反应体系中酶的总浓度为E0,当反应达到平衡以当反应达到平衡以 后后,酶分子以下列两种形式存在：酶分子以下列两种形式存在： E0=E+ES.(4) 将将3式分别和式分别和1式式4式加以整理便得：式加以整理便得： v=KpES/Ks.(5) E0=E+ES/Ks.(6) CH2.2 酶催化反应的

30、动力学酶催化反应的动力学 （3. Henri-Michaelis-Mentwen方程方程 ） 酶工程基本原理35 n 将将5式除以式除以6式得：式得： n n KpES/Ks KpS/Ks n v/E0= = .(7) n E+ES/Ks 1+S/Ks n将两边都乘以将两边都乘以1/Kp n S/Ks n v/KpE0 = .(8) n 1+S/Ks n n v=KpES 只有当只有当E0全部转变成全部转变成ES时，反应才能达到最大反应速度。时，反应才能达到最大反应速度。 n n Vm=KpE0.(9) 酶工程基本原理36 n 将将9式和式和8式整理得：式整理得： n S/Ks S n v/V

31、m = = .(10) n 1+S/Ks Ks+S n n VmS n v=.(11) n Ks+S n这就是这就是Hemri-Michaelis-Menten方程。方程。 n也就是我们所说的米氏方程。也就是我们所说的米氏方程。 酶工程基本原理37 n 我们总结一下，利用迅速平衡学说进行米氏方程的我们总结一下，利用迅速平衡学说进行米氏方程的 推导有以下三点基本假设：推导有以下三点基本假设： n 在反应模型中，不考虑在反应模型中，不考虑 ESE+P 的逆反应，然的逆反应，然 而，对于大多数酶促反应来说，反应是可逆的，要忽而，对于大多数酶促反应来说，反应是可逆的，要忽 略这一逆反应，只有在反应的起

32、始，产物略这一逆反应，只有在反应的起始，产物时才时才 成立。成立。 n S大大高于大大高于E值，在反应过程中，底物的消耗值，在反应过程中，底物的消耗 可忽略不计。可忽略不计。 n ES解离成解离成E+S的速度显著快于的速度显著快于ES形成形成E+P的速的速 度，即度，即ESE+P的反应不影响的反应不影响E+SES的平衡。的平衡。 酶工程基本原理38 CH2.2 酶催化反应的动力学酶催化反应的动力学 4 恒态学说及对米氏方程的修正恒态学说及对米氏方程的修正 事实上迅速平衡学说对很多反应不太适宜，为此，事实上迅速平衡学说对很多反应不太适宜，为此， 1925年，年，Briggs和和Handane对米

33、氏方程进行了修正，对米氏方程进行了修正， 提出了恒态学说。提出了恒态学说。其基本内涵是：在初速度测定过其基本内涵是：在初速度测定过 程中，底物浓度随反应时间而降低，产物相应增高；程中，底物浓度随反应时间而降低，产物相应增高； 而中间复合物而中间复合物ES可在相当一段时间内保持浓度的恒可在相当一段时间内保持浓度的恒 定状态。定状态。Briggs和和Handane对米氏方程的修正，保对米氏方程的修正，保 留了迅速平衡学说的前两点假设，因此，反应模型留了迅速平衡学说的前两点假设，因此，反应模型 仍为：仍为： k1 kp E+SESE+P -k1 酶工程基本原理39 n 底物的消耗速度为底物的消耗速度

34、为K1ES，底物的消耗用于底物的消耗用于ES的的 形成，形成，ES已经形成，就会按已经形成，就会按 -K1ES的速度解离成的速度解离成 E+S，同时同时ES按按KpES的速度形成的速度形成E+P。 n v=KpES.(1) n E0=E+ES.,.(2) n v/E0=KpES/E+ES.(3) n v/Vm=ES/E+ES.(4) 酶工程基本原理40 n 恒态学说认为恒态学说认为: n K1ES=K-1ES+KpES=(K- 1+Kp)ES.(5) n ES=K1ES/(K- 1+Kp).(6) n 定义定义:(K- 1+Kp)/K1=Km.(7) n ES=SE/Km.(8) 酶工程基本原

35、理41 n 将将(8)式代入式代入(4)式得：式得： n SE/Km n v/Vm= = S/(Km+S).(9) n E+SE/Km n VmS n v=.(10) n Km+S n n (10)式即为修正的单底物酶促反应动力学方程，为了纪念式即为修正的单底物酶促反应动力学方程，为了纪念 Michaelis-Menten创造性工作，这个方程也称为创造性工作，这个方程也称为Michaelis- Menten方程，简称米氏方程。式中方程，简称米氏方程。式中Vm为最大反应速度，为最大反应速度，Km为米为米 氏常数。氏常数。 酶工程基本原理42 CH2.2 酶催化反应的动力学酶催化反应的动力学 5

36、Lineweaver-Burk双倒数方程及双倒数方程及Km的测定的测定 n将米氏方程取倒数可得以将米氏方程取倒数可得以 下方程下方程: n Km 1 n1/V= . +1/Vmax n Vmax S n利用此方程作图即可计算出利用此方程作图即可计算出 酶的酶的Km和和Vmax。 n在设计测定以上参数的试验在设计测定以上参数的试验 时，需注意时，需注意S的取值范围，的取值范围， 一般应该在一般应该在Km值两侧设定值两侧设定S 值，经验数值是值，经验数值是0.33-2.0Km 范围为宜。范围为宜。 斜率斜率 =Km/Vmax 截距截距 =1/Vmax 截距截距=-1/Km 1/S 1/V 酶工程基

37、本原理43 CH2.2 酶催化反应的动力学酶催化反应的动力学 6关于米氏方程意义的讨论关于米氏方程意义的讨论 反应速度反应速度v是底物浓度是底物浓度S的函数，其几何意的函数，其几何意 义是一条双曲线。义是一条双曲线。 当当S远远大于远远大于KmSKm时：时： VVm；在测定酶活力时，必需提供足够大的底物浓度；在测定酶活力时，必需提供足够大的底物浓度； 反之，当反之，当SKm时，时，VVmS/Km，因为在一定条件下，因为在一定条件下， 对于一个酶来说，对于一个酶来说，Vm/Km是一个常数，所以，是一个常数，所以，反应速度反应速度V 与底物浓度与底物浓度S成直线关系，在酶法分析中，利用酶测定底成直

38、线关系，在酶法分析中，利用酶测定底 物浓度时，应提供足够大的酶浓度，使得产物与底物浓度物浓度时，应提供足够大的酶浓度，使得产物与底物浓度 成直线关系，成直线关系，以根据产物的形成来测定底物浓度。以根据产物的形成来测定底物浓度。 VmS v= Km+S 当当V1/2Vm时，时，Km S Km是酶促反应的动力学常数，其等于当达到最大速度一半是酶促反应的动力学常数，其等于当达到最大速度一半 时的底物浓度。时的底物浓度。Km值是酶的一个特征性常数，它不受酶量，值是酶的一个特征性常数，它不受酶量， 酶的纯度的影响，当酶的纯度的影响，当pH、温度、介质的离子强度等不变时，温度、介质的离子强度等不变时， K

39、m值不变。值不变。 它是酶与底物亲和力的标志，它是酶与底物亲和力的标志，Km值越大，标志要使反应速值越大，标志要使反应速 度达到最大反应速度一半时，必须提供的底物浓度越大，度达到最大反应速度一半时，必须提供的底物浓度越大， 即酶与底物的亲和力越小；反之亦反。即酶与底物的亲和力越小；反之亦反。 因为因为Vm=KpE0，所以，当底物浓度足够大所以，当底物浓度足够大 时，最大反应速度时，最大反应速度Vm与酶量成正相关，因此与酶量成正相关，因此Vm 是随酶量而变化的常数。催化反应的是随酶量而变化的常数。催化反应的Vm应换算成应换算成 酶的催化常数酶的催化常数Kcat，Kcat是每摩尔酶每分钟催化是每摩

40、尔酶每分钟催化 转化底物的摩尔数或产生产物的摩尔数。转化底物的摩尔数或产生产物的摩尔数。 酶工程基本原理44 影响酶促反应的因素 n一.底物浓度S n1.酶促反应速度V与底物浓度S的关系 酶工程基本原理45 酶工程基本原理46 影响酶促反应的因素 二二.酶浓度酶浓度 E 酶工程基本原理47 pH对反应速度的影响对反应速度的影响 用酶活力对pH作图，便得到一条钟形曲线。 图pH对酶活力的影响 pH 酶 活 力 CH2.2 酶催化反应的动力学酶催化反应的动力学 pH对反应速度的影响对反应速度的影响 酶工程基本原理48 npH对酶活力的影响主要表现在以下几个方面：对酶活力的影响主要表现在以下几个方面

41、： n pH的改变影响酶的空间构象，从而引起的改变影响酶的空间构象，从而引起 酶活力的改变。酶活力的改变。 n pH影响酶活性中心催化基团的解离，影影响酶活性中心催化基团的解离，影 响酶与底物的亲合力或催化活性。响酶与底物的亲合力或催化活性。 n pH影响底物的解离状态，改变底物的可影响底物的解离状态，改变底物的可 给性。给性。 酶工程基本原理49 CH2.2 酶催化反应的动力学酶催化反应的动力学 温度对反应速度的影响温度对反应速度的影响 温度对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度的影响 从实验结果来看，温度对酶活力的影响，类似于从实验结果来看，温度对酶活力的影响，类似于 pH对酶活力的影响，

42、以酶活力对温度作图，便得到对酶活力的影响，以酶活力对温度作图，便得到 一条钟形曲线。一条钟形曲线。 温度温度 酶酶 活活 力力 酶工程基本原理50 温度对酶活力的影响，主要表现在两个方面，温度对酶活力的影响，主要表现在两个方面， 一方面温度的改变影响着酶的稳定性，在低温一方面温度的改变影响着酶的稳定性，在低温 条件下，主要表现为可逆行失活，随温度的恢条件下，主要表现为可逆行失活，随温度的恢 复酶活力也得到恢复；在高温条件下，表现为复酶活力也得到恢复；在高温条件下，表现为 不可逆行失活。另一方面，温度直接影响酶促不可逆行失活。另一方面，温度直接影响酶促 反应的进行，根据反应的进行，根据Arrhe

43、nius方程：方程： k=Ae- Ea/RT 可以看出，速度常数可以看出，速度常数k与绝对温度与绝对温度T成成 正比。正比。 酶工程基本原理51 影响酶促反应的因素 n五五.激活剂对酶促反应速度的影响激活剂对酶促反应速度的影响 凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。 无机离子或简单有机化合物对酶的激活。 酶工程基本原理52 n1、 无机离子的激活作用无机离子的激活作用 n（1）金属离子：）金属离子：K+ 、Na+、Mg2+ 、Zn2+、Fe 2+ 、 Ca2+ n（2）阴离子：阴离子：cl-、Br -、PO43- n（3）氢离子氢离子 n不同的离子激活不同的酶。不同的离子激活不同的酶。 n不同

44、离子之间有拮抗作用和可替代作用，如不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与与 K+、Mg+与与Ca+之间常常拮抗，但之间常常拮抗，但Mg+与与Zn+常可替常可替 代。代。 n 激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用， 150mM 酶工程基本原理53 n2、 简单有机分子的激活作用简单有机分子的激活作用 n还原剂（如还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活还原型谷胱甘肽）能激活 某些活性中心含有某些活性中心含有SH的酶。的酶。 n金属螯合剂（金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离能去除酶中重金属离 子，解除抑制作用。子，解除抑制作用。 3、蛋白酶对

45、酶原的激活、蛋白酶对酶原的激活 酶工程基本原理54 抑制剂对酶促反应速度的影响抑制剂对酶促反应速度的影响 变性作用(denaturation)： 抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或丧失但 并不引起酶蛋白变性 变性剂没有选择性 抑制剂有不同程度的选择性 酶工程基本原理55 研究抑制剂对酶的作用有重大的意义： （1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开 （2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代谢 控制发酵 （3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化 学功能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程 和化学修饰酶、酶工业的基础 酶工程基本原理56 （二）抑制作用的类型二）抑制作用的类

46、型 1、不可逆的抑制作用 抑制剂与酶活性中心（外）的必需基团共价结合，使酶的活 性下降，无法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使 酶复活。 2、 可逆的抑制作用 抑制剂与酶蛋白非共价键结合，可以用透折、超滤等 物理方法除去抑制剂而使 酶复活。 酶工程基本原理57 （1）竞争性抑制（）竞争性抑制（Competitive inhibition） 抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的 活性中心，并与酶形成可逆的EI复合物，阻 止底物与酶结合。 可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。 丙二酸、戊二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 酶工程基本原理58 （2）非竞争性抑制竞争性抑制 底物和抑制剂可以同时与酶结合

47、，但是，中间的三元 复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活 性降低。 抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，其结构可能与 底物无关。 不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制 作用 某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性竞争性 抑制：抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+ 酶工程基本原理59 （3）、 反竞争性抑制反竞争性抑制 酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。 E+SES+I ESI P 常见于多底物的酶促反应中 酶工程基本原理60 （三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的 鉴别鉴别 1、通过透析、超滤、凝胶过滤等、通过透析、超滤、凝胶过滤等 2、通过

48、通过V-E速度曲线速度曲线 3、通过可逆抑制剂的动力学曲线可以区分动力学曲线可以区分 三种可逆抑制作用三种可逆抑制作用 酶工程基本原理61 1、 竞争性抑制：竞争性抑制： ) 1( max S K I K SV V i m 相对活力： 0 I Ki Km SKm SKm V V a i 抑制分数： 1 I Ki Km SKm I Ki Km ai 动力学方程： （Ki为EI的解离常数） 抑制程度决定于I、S、Km和Ki 酶工程基本原理62 竞争性可逆抑制图示竞争性可逆抑制图示 酶工程基本原理63 Vmax不变 Km变大，而且随I浓度的增大而增 大 交于y轴 酶工程基本原理64 竞争性抑制作用小

49、结： （1） Vmax不变，Km变大。 （2）抑制程度决定于I、S、Km和Ki A. 抑制程度与I成正比，与S成反比 I一定，增加S，可减少抑制程度。 S一定，增加I，可增加抑制程度。 B. 在一定I和S下， Ki越大，抑制作用越小， Km值愈大，抑制程度愈大。 酶工程基本原理65 2、 非竞争性抑制非竞争性抑制 1 max SKm S V V Ki I 相对活力：相对活力： IK K a i i 抑制分数： 1 IK I IK K i ii i 抑制程度决定于I和Ki，与底物的Km和S无关 动力学方程：动力学方程： 酶工程基本原理66 非竞争性可逆抑制图示非竞争性可逆抑制图示 酶工程基本原理

50、67 交于x轴 Km不变，Vmax降至Vmax/（1+I/Ki） 酶工程基本原理68 非竞争性抑制小结： （1） Km不变，Vmax降至Vmax/（1+I/Ki） （2）抑制程度决定于I和Ki ，与底物的Km和S 无关： 抑制程度与I成正比 在一定I 下， Ki越大，抑制作用越小 酶工程基本原理69 3、 反竞争性抑制反竞争性抑制 ) 1 ( max S K I K SV V i m 相对活力： 抑制分数： 动力学方程： S K I SK SK a i m m 1 SISKKK SI ai iim 抑制程度决定于Km、Ki、S、I 酶工程基本原理70 Km及Vmax都变小 一组平行直 线 酶工

51、程基本原理71 反竞争性抑制小结： （1）Km及Vmax都变小 (2)抑制程度决定于Km、Ki、S、I 抑制程度既与I成正比，又与S成正比 在一定的S、I下，Ki越大，抑制程度越小； Km越大，抑制程度越小。 酶工程基本原理72 表小结： 三种可逆抑制作用的酶促反应速度V与Km值 酶工程基本原理73 酶工程基本原理74 酶工程基本原理75 一般每一种酶有两个名称：一般每一种酶有两个名称： 一个是它的习惯名称，一个是它的习惯名称，其习惯名一般是根据它的催化底物来命其习惯名一般是根据它的催化底物来命 名的。淀粉酶名的。淀粉酶(Diastase)，蛋白蛋白(Protiase)，果胶酶果胶酶(Pect

52、inase)等。等。 另一个是其系统名称，另一个是其系统名称，国际生物化学协会国际生物化学协会(International Union of Biochemistry)酶学委员会酶学委员会(Enzyme Commission)。于于1961年年 该委员会正式提出了酶的系统命名方案。该委员会正式提出了酶的系统命名方案。 将底物和催化的反应同时考虑，进行命名，如：将底物和催化的反应同时考虑，进行命名，如：-1 ，4 葡萄糖水解酶；葡萄糖水解酶； 对于双底物的将两底物用冒号分开：如：对于双底物的将两底物用冒号分开：如：ATP:己糖磷酸己糖磷酸 转移酶；转移酶； 对可逆反应的，一般正反应和负反应用同一

53、个名称，主要对可逆反应的，一般正反应和负反应用同一个名称，主要 考虑催化的主要方向，或根据首先证明的催化反应来确定。如考虑催化的主要方向，或根据首先证明的催化反应来确定。如 乳酸脱氢酶。乳酸脱氢酶。 CH 2.3 酶的分类和命名酶的分类和命名 1 酶的命名原则酶的命名原则 酶工程基本原理76 CH 2.3 酶的分类和命名酶的分类和命名 2 酶的分类原则酶的分类原则 n1984年出台了一套目前为普遍接受的酶分类体系；根据酶催年出台了一套目前为普遍接受的酶分类体系；根据酶催 化反应的类型将酶分成大类，即：化反应的类型将酶分成大类，即： n氧化还原酶氧化还原酶.（1） n转移酶转移酶.（2） n水解酶水解酶.（3） n裂合酶裂合酶.（4） n异构酶异构酶.（5） n合成酶合成酶.（6） n酶的分类编号原则是采用四码编号方法，第一码代表大酶的分类编号原则是采用四码编号方法，第一码代表大 类中的哪一类，第二码代表大类中的亚类，第三码表示亚类中类中