MHC相合造血干细胞移植后cGVHD小鼠模型建立

1、实用标准文案MHC 相合造血干细胞移植后cGVHD 小鼠模型建立李海霞 1, 王 婵 2, 吴秉毅3, 张传仓 2 (审校 ), 封志纯 2 ( 1.北京军区总医院附属八一儿童医院 山西医科大学在读硕士研究生 ; 2. 北京军区总医院附属八一儿童医院 ; 3. 南方医科大学附属珠江医院 , 指导老师 ) 摘 要: 目的 建立主要组织相容性复合物 (MHC) 相合造血干细胞移植的慢性移植物抗宿主病 ( Chronic graft verse hostdisease,cGVHD)小鼠模型 , 为进一步研究cGVHD的发病机制及防治方法构建平台。方法以雄性 DBA/2H - 2d 为供 鼠, 雌性B

2、ABL /CH - 2d 为受鼠 , 接受 60 Co 515Gy 全身照射后分成3 组,4 6h 内完成移植。 A 组输注 RPM I1640培养液、 B 组输注 5107 个脾细胞 / 只、 C 组输注 10 107个脾细胞 / 只。（脾细胞移植作用？ ）观察指标为 : 1 造血重建时间 ;o 移植物植入情况各;?组小鼠 cGVH D 的临床表现 ; ? 各组的病理学改变及成模率。结果1造血重建 : C 组较 A、 B 组造血重建延迟 ,差异有统计 学意义。o 植入情况检测 : 移植组小鼠均为供、 受者共存的混合嵌合体。 ? cGVHD的临床表现及评分 : A 组均未出现cGVHD 的临床

3、表现 , B、C 组小鼠出现 cGVHD 的临床表现 , 两组的临床评分有统计学差异( P =01016) 。? 病理改变及 成模率 : A 组病理学未见明显异常 ; B、 C 两组出现 cGVHD 的病理学改变 , 但是两组评分无统计学差异( P =01410); 根 据病理学评分判断各组小鼠的成模率分别为0% 、60% 、 80% 。结论 60 Co 515Gy 全身照射后输注5 107 个脾细胞可诱导 出 cGVH D 小鼠模型 , 且配型方式与临床MHC 相合精彩文档实用标准文案造血干细胞移植类似 , 可以作为研究MHC 相合造血干细胞移植后cGVHD的理想模型。关键词 : MHC相合

4、 ; 慢性移植物抗宿主病( cGVHD);小鼠模型中图分类号 : R - 33文献标识码 : A文章编号 : 1006- 9534 ( 2010) 07- 0026- 05异基因造血干细胞移植是目前根治恶性血液系统疾病, 以及某些遗传性疾病、免疫缺陷病、实体瘤的最有效方法之一。但是慢移植物抗宿主病( cGVHD) 是异基因造血干细胞移植最主要的并发症和导致移植失败及患者死亡的重要原因之一 , 严重影响了异基因造血干细胞移植治疗的疗效。近年来 , 尽管移植方式不断改进和新的免疫抑制剂的不断研发 ,cGVHD 仍未得到理想的控制 , 究其原因是对 cGVH D 的 发病机制了解甚少。因而 , 建立

5、接近人类 cGVHD 病理机制 及临床表现的动物模型 , 对 cGVHD 的研究具有重要意义。 本实验受鼠减低剂量预处理后 , 输注 MHC 相合、次要组织相 容性抗原 (m HiA s)不相合的供鼠脾细胞 , 诱导出类似人类 cGVHD 表现的小鼠模型 , 为进一步研究 cGVH D 的发病机制 及防治途径提供平台。（背景）材料与方法1. 实验动物 : 供鼠为雄性 DBA /2H - 2d 小鼠 , 受鼠为雌性 BALB /CH - 2d 小鼠 , 均为 8- 12 周, SPF级, 由北京市维通利华 动物实验公司提供。饲养于北京大学医学部动物实验中心 SPF 级动物房内 , 给予无菌食物、

6、高压消毒无菌水、辐照消毒垫料。2. 主要试剂及仪器: RPM I1640( 无血清 )溶液 , 苔盼蓝染 液, 秋水仙素 , 固定液 (甲醇 B 冰醋酸 = 3B1), 倒置显微镜 , 超 净工作台 , 血细胞计数板 , 200精彩文档实用标准文案目不锈钢筛网 , 低温高速离心 机, 60 Co 放疗机 (由军事医学科学院辐照研究所提供 )。 3. 实验方法 : ( 1) 受鼠预处理、分组 : 受鼠 BABL/CH - 2d 移植前 5d 开 始饮用含庆大霉素 (320 mg /L) 和红霉素 ( 250 mg/L) 的饮用 水 , 直至移植后 2 周。移植当天采用 60Co C 射线全身照射

7、进 行预处理 , 照射剂量为 5. 5Gy （抑制免疫）。预处理后采用随机字表法分通讯作者 : 封志纯组, 如下 : A 组单纯照射组 ( n= 10, 经尾静脉输注 0. 5m lRP- MI1640 培养液 ), B 组 ( n= 10,经尾静脉输注 5 107 个脾细 胞 ),C 组 ( n= 10, 经尾静脉输注10 10 7 个脾细胞 )。各组 于照射后 4 6 h 内完成移植。 ( 2)供鼠脾细胞制备 : 将 DBA /2 供鼠颈椎脱臼处死 , 无 菌条件下解剖取脾 , 置 200目筛网研磨、过滤 , 制成单细胞悬 液 , 用红细胞裂解液裂解红细胞后, 调节细胞浓度为10 107

8、/m l 、20 107 /m l备用。 ( 3)外周血染色体制备 : 小鼠腹腔注射秋水仙素 3 4Lg/g, 5h 后以眼球摘除法 , 留取 0. 51m l 全血 (加肝素抗 凝 ), 0. 075mol/LKC l溶液低渗处理 , 反复 3次固定后滴片 , G iem sa 染色10m in, 室温晾干后镜检。 4. 观察指标 ( 1) 造血重建观察 : 于 - 1 、 7、14、21、28 天分别检测受鼠外周血白细胞情况 , 监测造血功能重建时间 ; ( 2) 移植物植入检测 : 实验终点 B、 C 组各选取 2 只小鼠 制备外周血单个核细胞染色体标本 , 计数 20 个分裂相 , 检

9、测 Y 染色体的阳性率 。 ( 3) cGVHD 的临床评分 : 脾细胞移植后每天观察小鼠一 般状态 , 包括体重、被毛、精彩文档实用标准文案姿势等 , 移植 14天后每 3 天进行一 次临床评分 , 评分标准参照国内外相关文献 1- 5的进行评 分,部分内容根据本实验略作修改。评分标准见表 1 5。 表 1 慢性 GVHD 的临床评分标准得分0分1分2分 3 分 脱毛 无 2cm2体重减轻 无或减轻 2% 2% 8% 8%弓背体态 无 不影响运动 影响运动 注: ( l) 耳朵、尾巴、脚掌每处脱皮或结痂记0.3 分,皮肤临床表 现最低得0分, 最高得 3.9分。 ( 2) 皮肤得分超过 0.

10、6 分视为发生 GVHD;即使症状消退、小鼠自然死亡或人为因素造成死亡也视为发 生 GVHD; 小鼠无症状死亡视为无GVHD 。#26# 中国优生与遗传杂志 2010 年第 18 卷第7 期( 4) 慢性移植物抗宿主病的病理评分 : 濒死小鼠或实验 终点颈椎脱位处死小鼠 , 解剖 , 取皮肤 (肩胛部或病变部位 )、 肝脏、小肠、肾脏等器官 , 经 10% 福尔马林固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、 HE 染色等制备病理切片 , 镜下观察并评分。评 分标准见表 2。表 2 慢性 GVHD 的病理评分标准 1, 5得分 0分 1分 2分 3分 4分皮肤 表皮 正常 轻度增生 明显增生 真皮 正常 轻

11、度改变伴少量胶原沉积 大量胶原沉积 炎症 无 局灶性浸润 广泛浸润 皮下脂肪 正常 脂肪细胞减少 严重萎缩 毛囊 (个 /mm) 5 1 5 1 肠道炎症 无 轻度 中度 重度无溃疡 重度有溃疡肝脏精彩文档实用标准文案正常或 10 107个脾细胞可能出现急性移植物抗宿主病( aGVHD) 表现 11 。我们建立的小鼠模型符合B il-lingham提出 GVHD 发生的三个条件 : ( 1) 移植物中必须有足够的免疫活性细胞 ; ( 2) 受者必须表达有不同于供者的抗原; ( 3) 受者无法发挥对移植物的有效排斥反应 12。本模型小鼠的临床表现为体重下降、脱毛等 , 组织病理学改变以皮肤、肝脏

12、、肾脏等病变为主, 这与人类 cGVHD 的 临床表现相似。模型小鼠的发病时间多集中在移植后 30 45 天, 与国外文献报道 MH C 相合 (m HiAs 不相合 )的模型的 发病时间相一致 1 。实验中 , 我们设立单纯照射组 , 一方面用来排除照射引起体重下降、皱毛、食欲下降等的效应,另一方面单纯照射组4 周后血象逐渐恢复正常 , 说明预处理为非清髓性。非精彩文档实用标准文案清髓性预处理是模拟临床减低预处理强度, 增加了小鼠的耐受性,降低实验小鼠的死亡率, 更有利于实验的观察和后续干预实验的进行。实验 C 组输注脾细胞数量是B 组的 2 倍, 体重下降时间及发病时间均较B 组提前 ,

13、其临 床评分较B 组严重 , 结果表明cGVHD 的发病情况及疾病的严重程度与供者来源的淋巴细胞数量相关, 这与国外 H ar-i das 11的报道结果也是相符合的。C 组小鼠的生存期相对 短, 似乎与 cGVHD 不相符 , 但是病程中 C 组小鼠均未出现体重急剧下降、严重腹泻等 aGVHD 表现 , 移植后逐渐出现头背 部脱毛, 随着时间的推移 , 脱毛范围逐渐扩大 , 肝脏病理学改 变出现大面积汇管区淋巴细胞浸润 , 胆管坏死等 cGVHD 表 现, C 组小鼠死亡考虑与 cGVHD 的严重程度相关。相关文 献报道 : 小鼠供受体遗传背景以及预处理条件的差异可导致 移植物抗宿主疾病类型

14、以及靶器官表现的差异 13 , 供者 DBA /2 缺少适当数量的 CD8+ T 细胞和细胞毒性（ 致 aGVHD ） T (CTL)细 胞可能是引起 cGVHD 的决定因素 14 。B、 C 组小鼠均可诱导出 cGVH D 表现 , 但 C 组小鼠的疾 病程度严重 , 病情进展快 , 实验终点死亡率高 , 不适合用于 cGVHD 模型诱导。 B 组小鼠的发病时间相对集中 , 且可以出 现典型的 cGVHD 临床表现和病理学改变 , 病变较稳定 , 患病 率与 C 组无 统计学 差异 ,作为研 究 MHC 相匹配 移植后 cGVHD 的疾病模型较为理想 , 为深入研究 cGVHD 的致病因 素

15、及防治措施提供良好的实验工具。 本模型的优点 : 1 更接近临床 : 采用 MHC 匹配的两种小 鼠进行移植精彩文档实用标准文案实验 , 与临床MHC 匹配异基因移植方式相类似; 模拟临床减低强度预处理的非清髓性照射, 通过淋巴细胞回输诱导出cGVHD疾病的小鼠模型。 o 成模时间相对短 , 临 床症状稳定 : 模型组小鼠的发病时间多集中在脾细胞输注后30 45天内 , 症状延续到实验终点。?模型动物的选择 : CD8+T 细胞是aGVHD的 效应细胞 , CD4+T细 胞主要与 cGVHD 有关 , V ia14 等研究 DBA /2 小鼠与 C57BL /6 小鼠脾 细胞相比 , CD8+

16、 T 细胞少 2 倍, 因此选择 DBA /2 小鼠作为供 鼠较 C57BL/6 小鼠作为供鼠 , 更易发生 cGVHD 。 本实验的不足之处是未建立本模型的评分系统 , 在临床 评分及病理评分方面存在一定的局限型, 在今后的研究中模型评分系统尚需不断改进。参考文献 1Y aron Ilan, et a.l Induction of oral tolerance in splenocyterecipients toward pretransplant antigens ameliorates chronic graft versus host dis-ease in a murinemodel

17、 J. J Blood, 2000 Jun 1, 95( 11): 3613- 9. 2Anderson BE, M cN iff JM, Jain D, et a.l D istinct roles for donor- and host- derived antigen- presenting cells and costimulatory moleculesin murinechronicgraft-versus-hostdisease:requirementsdepend on target organ J. Blood, 2005, 105( 5): 2227- 2234. 3M a

18、tte CC, L iu J, Cormier J, et a.l DonorAPCs are required精彩文档实用标准文案formax-i malGVHD but not forGVL J. NatM ed, 2004, 10( 9):987- 992. 4Anderson BE, M cN iff JM, M atte C, et a.l Recipient CD4+ Tcells that survive irradiation regulate chronic graft- versus-host disease J.Blood, 2004, 104( 5): 1565- 15

19、73. 5吴远彬 , 等. 单倍体相合造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病小鼠模型的建立及其评价 J.中国组织工程研究与临床康复 , 2008, 12( 12): 2326- 2330. 6 Sullivan KM. Graft- vs- host disease. In: Blume KG, FormanSJ, Ap- pelbaumFR,eds.ThomascHematopoieticCellTransplantation. M a-lden, MAM . BlackwellScience,2004. 635- 664. 7Lee SJ,Vogelsang G, FlowersME. Chr

20、onic graftversus- host disease J. Biol BloodM arrow T ransplan,t 2003, 9: 215- 233. 8 LeeSJ. N ew approaches for preventing and treating chronic graft-versus- host diseaseJ. Blood,2005, 105: 4200-4206. 9Farag SS. Chronic graft- versus- host disease: where do we gofromhere? J. BoneM arrow T ransplan,

21、t 2004, 33: 569- 577. 10宋阿霞 , 等. 慢性移植物抗宿主病发病机制的研究进展 J.国 际输血及血液学杂志 , 2008, 31( 4): 347- 350. 11HaridasV,K amatRS. Antigenpresentingcells(APC) of精彩文档实用标准文案mice w ith chronic graft- versus- host disease( GVHD ) causeexcessive activa-tion-induceddeathof T helpercellsJ. Clin Exp mImuno,l1997, 110( 3): 45

22、4- 463. (下转第38 页 )#29# 中国优生与遗传杂志2010 年第 18 卷第 7 期表 1 28 例异常染色体异常结果类别 核型 例数 常染色体三体 10 例( 37104% ) 47, XX, + 21 2 47, XY, + 21 1 47, XX, + 16 2 47, XX, + 22 1 47, XY, + 18 1 47, XX, +15 1 47, XX, + 22 1 47, XX, + 9 1性染色体单体6 例 ( 22122% )45, XO 6三倍体6 例 ( 22122% ) 69, XXX 4 69, XXY 2嵌合体2例 ( 11111% ) 69,

23、XXY /48, XY, + 21, + 22 1 47, XY, + 21 /46, XY1 四倍体 1例( 3170% ) 92, XXXX 1 双重三体 1 例 ( 3170% ) 48,XX,+21,+181性染色体异常 1例 ( 3170% ) 47, XXY ( FISH法 )1 结构异常1 例 ( 3170% ) 45, XO /46, X i(X q) 1表 228例异常染色体种类情况类别 例数 比例 % 45, XO 6 21142三倍体 6 2114221- 三体 310171 16- 三体 2 7114 嵌合体 27114 9- 三体 1 3157 15-三体 1 315

24、7 18- 三体 1315722-三体1 3157 47, XXY ( FISH法 )1 3157 四倍体 1 3157双重三体 1 3157 结构异常 1 3157型分析 , 同时对培养失败标本以FISH 进行诊断。结果显示 在 85例自然流产绒毛染色体中 , 异常核型 28例, 检出率为 32194% ,与研究发现的早期难免流产中3015% -5419% 的 流产儿具有异常精彩文档实用标准文案染色体的文献报道基本符合 2 。 通过结果分析 , 异常染色体 28 例核型中 , 染色体数目异 常 27 例, 占 96142% , 结构异常 1 例,占 3157% 。说明染色体 异常是导致早期自

25、然流产的最重要原因 , 而染色体的异常主 要还是数目的异常。具体核型分布见表 1 。结果显示三体型 是最常见的 , 其中又以 21 、16 三体居多 , 这与以往的研究接 近 3 。但我们同时又发现 , 在异常结果中 , 性染色体单体 ( 45, XO) 占的比例很大 (表 2), 共 6 例, 占 21142% 。由此我们推测, 性染色体单体 (45, XO) 很少能存活到怀孕的中晚期 , 更容 易发生早期流产。这一推断还需得到更多的资料的支持。2. 荧光原位杂交 (FISH )是应用特殊荧光素标记的染色 体 DNA 探针, 对未培养的绒毛组织进行原位杂交来诊断染色体异常。 1997年 Jo

26、banputra 等和 2003 年 Kucheria 等 4 又 应用间期 FISH来诊断新鲜的流产组织 , 使用了两组探针 , 能 辨认出染色体 13, 15, 16, 18, 21, 22, X 和 Y。研究发现应用 上述探针能辨认出自然流产组织中 80% 的染色体异常 , 证实 其为快速有效的方法 , 克服了细胞培养费时费力等问题 , 母 细胞污染的影响小。 FISH 允许分析大量的间期核 , 因此也 是鉴别嵌合体的有效方法。本研究对培养失败的绒毛组织 进行荧光原位杂交很好的解决了细胞培养所存在的失败率 的问题。给病人及临床提供了有效的依据。 3. 目前国内外最为常规的针对自然流产的检

27、查是对夫 妻双方进行外周血染色体的核型分析 ( G 显带法 )。据研究 表明 , 外周血染色体核型分析只能为214% 510% 5, 6的自 然流产患者找到病因。因此, 开展绒毛精彩文档实用标准文案组织的染色体检查是 相当有意义的。 4. 综上所述 , 胚胎染色体异常是自然流产的重要病因 , 如果能对自然流产绒毛进行常规染色体检查, 将对了解本次 流产的原因 , 能及时作出判断 , 并有针对性地指导下一次受 孕。同时 , 由于常规染色体检查方法还存在着不足 , FISH只 能诊断染色体数目异常 , 不能检测结构重排 , 并且对陈旧组 织的诊断中对探针的要求高 , 另外 , 制备探针需了解待测区

28、 域, 某些基因区域的特异探针尚不能获得 , 使 FISH 的应用存 在一定的局限。我们还需要致力于新的检测技术的研发, 如 比较基因组杂交 (CGH ) 、光谱核型分析 ( SKY)等, 以期对自 然流产的研究有更大的突破。参考文献 1M acklonNS, Geraedts JP, FauserBC. Conception to ongoingpregnan- cy the black boxc of early pregnancy loss J. Hum Reprod, 2002, 8 ( 4): 333- 43. 2顾世光 , 高尔生 , 赵鹏飞 , 主编 . 生殖健康M . 北京 : 人民卫生出版社 , 1998174-75. 3 CarreraM. Screening prenatal de aneuploid- PCR vs FISH J. Prog D iag Prenat, 2001, 13: 262- 6. 4Kucheria K, Jobanputra V, TawlarR, et a.l Hum