海滨木巴戟种子超低温保存技术规程

1、ICS11.120.01C 23团 体 标 准T/CACM 00X2019海滨木巴戟种子超低温保存技术规程Technical procedures for cryopreservation of Morinda citrifolia L. seeds 2019-0X-0X发布2019-0X-0X实施中华中医药学会 发布T/CACM 0012019目 次目 次I前 言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 种子的选择15 种子前处理26 种子保存量27 种子冷冻方式28 恢复培养2附录3参考文献4前 言本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出

2、的规则起草。本标准由中国医学科学院药用植物研究所海南分所提出。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位：中国医学科学院药用植物研究所海南分所，中国医学科学院药用植物研究所。本标准主要起草人：曾琳，魏建和，李榕涛，郑希龙，王秋玲，何明军，金钺，顾雅坤，符丽，谭红琼。IIT/CACM 0012019海滨木巴戟种子超低温保存技术规程1 范围本标准规定了海滨木巴戟Morinda citrifolia L.种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于海滨木巴戟种子的超低温长期贮藏。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可

3、少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定GB/T 3543.7 农作物种子检验规程 其他项目检验3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1海滨木巴戟 Morinda citrifolia L.为茜草科（Rubiaceae）巴戟天属（Morinda）灌木或小乔木，也称海巴戟、海巴戟天，生于热带地区海滨平地和疏林中，树冠幽雅，东南亚常种于庭园。果实可食，其果实、叶子、枝干、根部均可入药，具有抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、镇痛、降压、消炎和提高免疫力的作用

4、。全株含蒽醌类化合物，波利尼西亚将其应用于医药已有2000多年的历史。收载于世界药用植物速查辞典（2015）。3.2海滨木巴戟果实 Morinda citrifolia L. fruits聚合果浆果状，长卵形或球形，径约2.5 cm；幼时绿色，熟时白色或黄色。有时最下部的小核果的宿存花萼扩大成叶状，核果卵形，扁平，边缘具翅；二室，上侧室大而空，下侧室狭，具1种子。3.3海滨木巴戟种子 Morinda citrifolia L. seed海滨木巴戟的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子黑褐色，长圆形，小，扁，下部有翅；胚直，胚根下位，子叶长圆形；胚乳丰富，质脆。3.4种子超低温保存

5、 seed of cryopreservation 指将经过前处理的海滨木巴戟种子置于液氮（-196）中保存。4 种子的选择4.1 果实采收花果期全年，全果变奶黄或金黄色时，即可时采收，去除果肉，取出种子。4.2 种子选择挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于4 冰箱中保存备用（存放时间不超过2个月）。5 种子前处理5.1 生活力检测参照植物生理学实验指导中的溴麝香草酚蓝（BTB）法测定种子生活力。待测种子在30 35 温水中浸种2 h，随后取吸胀种子50 粒，整齐地埋于备好的琼脂凝胶中，注意要将胚埋入凝胶中。将培养皿置于35 温箱中5h后观察结果。5.2 生活力计算在光下用放大镜对染色结果进行

6、观察鉴定。凡种胚周围出现黄色晕圈的种子为有活力的种子，否则为无活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数100%待保存的海滨木巴戟种子生活力应90%。5.3 含水量范围用尼龙网袋包裹海滨木巴戟种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为19000:1，室温条件下干燥处理15 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由18%25%降至10%15%。参照GB/T 3543.6中的高恒温烘干法（130烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重100%。6 种子保存量海滨木巴戟种子保存量不少于350粒，以便后期的活力检测使用。7 种子冷冻方式海滨木巴戟种

7、子超低温保存的冷冻方式为直接冷冻法，即将待保存的海滨木巴戟种子放入5 mL冻存管（每管50粒种子）中，迅速投入液氮中保存。8 恢复培养8.1 种子解冻处理液氮中至少冻存24 h后，取出1个冻存管，立即放入40 水浴中快速解冻2min。8.2 冻后种子生活力检测取出25粒解冻后的种子，参照5.15.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力60%时视为保存成功。8.3 恢复培养将剩下25粒解冻后的海滨木巴戟种子，经50 热水浸泡8 h后，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，温度28 35 ，湿度70% 85%条件下培养。附录BTB的配制和保存方法精密称取BTB 0.5 g，溶

8、解于煮沸过的500 mL纯水中。滤液若呈黄色，可加数滴氢氧化钠溶液，使之变为蓝色或蓝绿色，随后加入3.5 g琼脂溶解，稍稍冷却即可趁热倒入9 cm 培养皿中，使之成一均匀的薄层，完全冷却后备用。 参考文献1 肖培根，刘昌孝，江纪武等.世界药用植物速查辞典M. 中国医药科技出版社.20152 中国科学院中国植物志委员会. 中国植物志.第71(2)卷M. 科学出版社, 2004(1999)：1823 Chen Tao, Zhu Hua,Chen Chia-jui. Rubiaceae M /Flora Of China Beijing: Science Press/St. Louis: Missouri Botanical Garden Press. 2011. 19: 220-230.4 Reed BM. Plant CryopreservationA Practical GuideM. Spr