d6 酶固定化蛋白质工程

1、 Understanding enzyme immobilisation nEnzymes are versatile catalysts in the laboratory and on an industrial scale. To broaden their applicability in the laboratory and to ensure their (re)use in manufacturing the stability of enzymes can often require improvement. Immobilisation can address the iss

2、ue of enzymatic instability. Immobilisation can also help to enable the employment of enzymes in different solvents, at extremes of pH and temperature and exceptionally high substrate concentrations. At the same time substrate-specificity, enantioselectivity and reactivity can be modified. However,

3、most often the molecular and physical-chemical bases of these phenomena have not been elucidated yet. Chem Soc Rev. 2009 Feb;38(2):453-68. Hanefeld U, Gardossi L, Magner E. Recent advances in immobilized enzymatic reactors and their applications in proteome analysis nImmobilized enzymatic reactors r

4、ecently have drawn much attention because of the striking advantages, such as high substrate turnover rate and ease in coupling with the separation and detection systems. Carrier materials, which have great effects on the development of the immobilized enzymatic reactors, have always being the focus

5、 of study. In this paper, the contributions, mainly in the last 5 years, on the enzymatic reactors and their applications in proteome study are reviewed, with some newly developed inorganic and organic carriers for enzyme immobilization described in details. Moreover, the hyphenation of immobilized

6、enzymatic reactors with the separation and identification systems is also summarized. By reviewing these achievements, it could be seen that enzymatic reactors have very bright future, especially in proteome analysis Anal Chim Acta. 2009 Jan 19;632(1):1-8. Ma J, Zhang L, Liang Z, Zhang W, Zhang Y. 固

7、定化酶的研究内容固定化酶的研究内容 固定化方法 载体 酶学性质固定化酶的特性 稳定性研究、改进 最适温度 最适pH 底物特异性 固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法 （一）（一） 吸附法吸附法 n1 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体 吸附在其表面上。 n 选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。 优点：固定化时酶分子的构象很少 或基本不发生变化。 缺点：结合力弱，易解吸附。 载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、 沸石及硅胶等。 （二）结合法（二）结合法 n1 离子键结合法 q酶分子 含有离子交换基团的固相载体 n常用载体:DEAE-纤

8、维素， DEAE-葡聚糖凝胶 n使用注意：pH、离子强度、温度 2 共价键结合法共价键结合法 n（1）酶分子中可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚 基，二硫键 n（2）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机 载体 共价键结合法制备固定化酶的共价键结合法制备固定化酶的“通式通式” n首先载体上引进活泼基团 n 关键 n 然后活化该活泼基团 n 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键 （4）载体活化的方法）载体活化的方法 nA重氮法 nB叠氮法 nC烷基化反应法 nD硅烷化法 nE溴化氰法 A重氮法重氮法 n目前用的较多的载

9、体是对氨基苯磺酰乙基 （ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼 脂等 A重氮法重氮法 n反应式及原理 B 叠氮法叠氮法 n例 n用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白 酶，步骤如下： n 酯化 n 肼解 n 叠氮化 n(4) 偶联 B 叠氮法叠氮法 n对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚 硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联 C烷基化反应法烷基化反应法 n含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化， 形成含有卤素基团的活化载体。 D硅烷化法硅烷化法 n一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。 n多孔玻璃特点： n机械强度好，表面积大。 n耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以

10、再生， 寿命长等。 D硅烷化法硅烷化法 D硅烷化法硅烷化法 D硅烷化法硅烷化法 E 溴化氰法溴化氰法 n主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡 聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔 网状结构）。 n用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很 广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。 E 溴化氰法溴化氰法 （三）交联法（三）交联法 n借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用， 制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。 也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 （三）交联法常用试剂（三）交联法常用试剂 n常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N乙烯马来亚胺、双 重氮联苯胺等。 n

11、应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白 质的游离氨基形成席夫碱(shiff) 双功能试剂：双功能试剂： 常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O O H C CH2 CH2 CH2 C H 第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间得到一种分子间 交联的固定化酶交联的固定化酶 图 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性 的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶 表 常用于固定化酶的交联剂 交联剂 参考文献 戊二醛1316 二重氮联苯胺2，2二磺酸17，18

12、4，4二氟3，3二硝基二苯砜 19 二苯基4，4二硫氰酸2，2二磺酸 20 1，5二氟2，4二硝基苯 21 酚2，4二磺酰氯 22 3甲氧基二苯基甲烷4，4二异氰酸盐 23 （三）交联法的形式（三）交联法的形式 n交联法有2种形式：酶直接交联法 n 酶辅助蛋白交联 n双重固定法 （1） 吸附交联法 n（2） 交联包埋法 酶直接交联法酶直接交联法 n在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 n固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度 和反应时间之间的平衡。 酶辅助蛋白交联酶辅助蛋白交联 n为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶 失活， n可使用第二个“载体”蛋白质（

13、即辅助蛋白质，如白蛋 白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度， n使酶与惰性蛋白质共交联。 （1） 吸附交联法吸附交联法 n先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其 他大孔型离子交换树脂上， n再用戊二醛等双功能试剂交联。 n用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。 （2）交联包埋法）交联包埋法 n把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合 体， n然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。 n这样制得的固定化酶稳定性好。 （四）（四） 包埋法（包埋法（entrapping method） n定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体 中，使酶固定化的方法称为包埋法。 n包埋法分为网

14、格型和微囊型 n1网格型 n2微囊型 1网格型网格型 n(1) 概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格 中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型 包埋法。也称为凝胶包埋法 2微囊型包埋法微囊型包埋法 n是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制 成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只 有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。 微囊化法制备固定化酶有两种方法微囊化法制备固定化酶有两种方法 n 界面沉淀法 n界面聚合法 界面沉淀法界面沉淀法 n这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和 有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。 界面聚合法界面聚合法 n是用化学手段制备微囊的方法。

15、利用油水界 面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起 来。 各类固定化方法的特点比较各类固定化方法的特点比较: 比较项目吸附法结合法 交联法包埋法 物理吸附.共价键结合离子键结合 制备难易易难易 较难较难 固定化程度弱强中等 强强 活力回收率较高低高 中等高 载体再生可能不可能可能 不可能不可能 费用低高低 中等低 底物专一性不变可变不变 可变不变 适用性酶源多较广广泛 较广 小分子底物、 药用酶 化学偶联 酶酶 固定化固定化 间歇间歇 可溶可溶 交联包埋吸附 间歇间歇连续连续 选择方法依据：选择方法依据： n（1） 酶的性质 n（2） 载体的性质 n（3） 制备方法的选择 固定化后酶的考察项目

16、：固定化后酶的考察项目： n（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过 程的活力回收率。 n（2） 考察固定化酶稳定性 n（3） 考察固定化酶最适反应条件 一一 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素 1 酶本身的变化发生了变化 n活性中心的氨基酸残基 n高级结构 n电荷状态等 一一 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素 2 载体的影响 n（1）扩散限制效应 n（2） 空间障碍效应 二二固定化后酶性质的变化固定化后酶性质的变化 1 固定化对酶活性的影响： n酶活性下降，反应速度下降 n原因？ 二二 固定化酶的性质固定化酶的性质 2 固定化对酶稳定性的影响 n（1） 操作稳定性提高

17、 n（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 n (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 n (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 n（5） 对变性剂的耐受力升高 2 固定化后酶稳定性提高的原因：固定化后酶稳定性提高的原因： na. 固定化后酶分子与载体多点连接。 nb.抑制自降解，提高了酶稳定性。 3 pH的变化的变化 nPH对酶活性的影响： n（1） 改变酶的空间构象 n（2）影响酶的催化基团的解离 n（3）影响酶的结合基团的解离 n（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合 或结合后不能生成产物。 4 最适温度变化最适温度变化 n一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。 n5 底

18、物特异性变化 n作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化 n既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。 6 米氏常数米氏常数Km的变化，的变化，Km值随载体值随载体 性质变化性质变化 n（1） 载体与底物带相同电荷，KmKm固定化酶降低了 酶的亲和力。 n（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，KmKm 三、评价固定化酶的指标：三、评价固定化酶的指标： n1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶 活力单位。 n 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示 （酶膜、酶管、酶板）。 n2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需

19、要的时间（t1/2） 三、评价固定化酶的指标：三、评价固定化酶的指标： n3. n4. n或称偶联效率，活力保留百分数。 n5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与 游离酶活力的比值称为相对酶活力 n 细胞固定化细胞固定化 n固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细 胞称为固定化细胞. n该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定 化活细胞或固定化增殖细胞。 固定化细胞的特点固定化细胞的特点 n类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞 n生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器） n 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞） n形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或

20、不规则形状。 n 最多使用：颗粒状珠体 n使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性， 只要载体不解体，不污染就可以长期使用。 固定化培养优点固定化培养优点 n细胞可维持在较小体积培养液中生长； n细胞损伤程度低； n易于更换培养液； n细胞和培养液易于分离； n培养液中产物浓度高，简化了产品分离纯化 操作。 细胞固定化培养法细胞固定化培养法 n动物细胞限制或定位于特定空间位置的培养 技术谓之细胞固定化培养法。动物细胞几乎 都可采用固定化方法培养。固定化方法有： q吸附法（所用载体有陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗 粒 ） q包埋法 （将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血 纤维等海绵状基

21、质中） 吸附法吸附法 n它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载 体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞 固定在载体上的。 影响吸附法的主要因素影响吸附法的主要因素 n（1）Z-电位： Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大 小 n（2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质 n（3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料 包埋固定法包埋固定法 n包埋法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情 况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固 定化方法。 n包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活 力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。 包埋法分类包埋法分类 n

22、常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、 聚丙烯酰胺 n常用凝胶包埋法 举例海藻酸钙包埋法举例海藻酸钙包埋法 n基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀 菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀， 然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中 （常用CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞 通过改变载体溶液参数包埋细胞通过改变载体溶液参数包埋细胞 n改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和 溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态， 将细胞包埋其中。 研究热点研究热点光交联树脂包埋法光交联树脂包埋法 n例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等， 加入1%左右的光敏

23、剂，加水配成一定浓度，加热至50， 然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度 的薄层，用紫外照射3min，就可制得 固定化培养装置固定化培养装置 n多层平板装置 n螺旋卷膜培养器 n多层托盘式培养器 n卷带式培养器 n中空纤维及流化床式培养器 中空纤维培养器优点中空纤维培养器优点 n细胞生长密度高，可达l08个毫升以上，细 胞处于接近生理状态的理化梯度中； n营养物质可有效分布，代谢废物可及时排除； n细胞培养可达数月，易于实现连续培养； n细胞分泌的蛋白质浓度高。产品纯度可高达 60一90；利于降低成本； n反应器体积小并可用于培养多种细胞。 微载体培养方法微载体培养方法 n将动物细

24、胞吸附于微载体表面，在培养液中进行 悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养 方法称为微载体培养法或微珠培养法。 n制备微载体的材料主要有： q葡聚糖（DEAESephadex A50及A25 ） q塑料 q明胶 q玻璃 q纤维素 微载体培养优点微载体培养优点 n兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相 培养。 n细胞所处环境均一，放大容易。 n培养操作可系统化、自动化，障低了污染发 生的机会。 固定化原生质体固定化原生质体 n何为原生质体？ n有何优点？ 一一 原生质体的制备原生质体的制备 n将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压 稳定剂的高渗缓冲液中加入水解酶分 离得到原生质体 高渗缓冲液

25、高渗缓冲液 n高渗缓冲液处理指对细胞或组织进行渗透压 调节，即受体组织或细胞在适当浓度的高渗 液进行一定时间的浸泡处理。 n靶体经过高渗液一定时间的处理，体积缩小 到原来的80%左右，细胞膜内外形成一个渗 透压梯度。 n渗透压调节能导致细胞发生质壁分离，阻止 细胞质外渗，减少细胞的损伤，提高细胞的 活性，在基因枪法、电击穿孔法、微注射法 等直接转化方法都有应用。 n首先必须消除细胞壁，它是微生物细胞之间 进行遗传物质交换的主要障碍。通常采用蜗 牛酶除去细胞壁， n缓冲液 (1) 0.1 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。 (2) 高渗缓冲液，于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。

26、n原生质体稳定液(SMM) 0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC12、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。 n(一) 原生质体的制备 1活化菌体 将单倍体酿酒酵母菌Y-1 和Y-4 活化分别转接 新鲜斜面。自新鲜斜面分别挑取一环接入装 有25 mL 完全培养基的锥形瓶中，30培养 16 h 至对数期。 n2离心洗涤、收集细胞 分别取5 mL 上述培养至对数生长期的酵母细胞培养 液，3000 r/min 离心 10 min，弃上清液，向沉淀的 菌体中加入5 mL 缓冲液，用无菌接种环，搅散菌体， 振荡均匀后离心洗涤一次，再用5 mL 高渗缓冲液离 心洗涤一次。 n将菌

27、体分别悬浮于5 mL 高渗缓冲液中，振荡均匀， 分别取样0.5 mL，用生理盐水稀释至10-6，分别各 取0.1 mL 10-4、10-5、10-6 稀释液。 n于相应编号的完全培养基平板上(每个稀释度做两个 平板)，用刮棒涂布，30培养48 h 后进行总菌数测 定。 n 3. 酶解脱壁 各取3 mL 菌液于无菌小试管中，3000 r/min 离心10 min，弃上清液，加入3 mL 含2.0 mg 蜗牛酶的高渗缓冲液(此高渗缓冲液含有0.1 EDTA 和0.3SH-OH）于30振荡保温，定 时取样镜检观察至细胞变成球状原生质体为 止，此时原生质体形成。 n (二) 原生质体再生及剩余菌数的测

28、定 1再生 分别吸取0.5 mL 原生质体(经酶处理)加入装 有4.5 mL 高渗缓冲液及4.5 mL 无菌水试管中。 经高渗缓冲液稀释至10-5；分别吸取0.1 mL 10-3、10-4、10-5。稀释液于相应编号的再 生培养基平板上，30培养48 h 后，进行再 生菌数测定(用双层再生培养基)。 n 2. 未脱壁菌数测定 分别取0.5 mL 原生质体至装有无菌水试管中， 稀释到10-4；各取0.1 mL 10-2、10-3、10-4 的稀释液于相应编号的完全培养基平板上， 30培养48 h 后，进行未脱壁菌数测定。 二二 原生质体固定化的方法原生质体固定化的方法 n将原生质替制备好后，把离

29、心收集到的原生质体 重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成 一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制 成固定化原生质体。 四四 辅酶固定化辅酶固定化 n1 原因 n有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应 n有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 n有机辅因子价格昂贵 n工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生 辅酶固定化的方法：辅酶固定化的方法： n2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法 以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修 饰后固定在超滤器中。 n3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。 辅酶的固定化辅酶的固定化 辅酶固定

30、化的形式：辅酶固定化的形式： 生物催化剂 细胞酶 非生长生长可溶固定化 悬浮固定化连续 间歇 吸附包埋交联化学连续 材料膜固定 酶液 凝胶 吸附 化学连接物 固定化 再循环系统 凝胶 吸附 连续 半连续 分批 间歇 连续 活塞模式 搅拌连续反应器 间歇 连续 活塞模式 搅拌连续反应器 图 生物催化剂作用方式示意 固定化酶（细胞）的应用固定化酶（细胞）的应用 n固定化酶和细胞的应用（工农业、医药、分析化 学、酶电极、亲和色谱、环境保护、能源开发、 基础理论研究） 二固定化酶（细胞）的应用二固定化酶（细胞）的应用 n1. 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用 n2 固定化酶在医药治疗上的应用 n3

31、 固定化酶在分析化学中应用 n4 固定化酶和亲和色谱 n5 固定化酶与环境保护 n6 新能源开发中的应用 n7 固定化酶在基础理论研究中应用 1 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用 n葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶。 n利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶 n固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类 n热点：固定化原生质体的应用 固定化酶在工业生产上的应用 乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸 乙酰乙酰 -D Ala Aminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶 泵泵 储 罐 反应产物 离心机离心机 消消 旋旋 反反 应

32、应 器器 固定化酶 柱子 晶体 L-Ala L-Ala A-D-Ala A-L-Ala A-D-Ala 2 固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在医药治疗上的应用 n例1 n固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就 可以生成不同的产物。 酶促合成头孢类抗生素酶促合成头孢类抗生素 n - Reversible reaction n - Hydrolysis of substrate or product by biocatalyst n - Difficulty of separation of product from reactants CHCOOCH3 NH2 CHCOOH NH2 CHCONH N S O C