聚丙烯酰胺凝胶电泳PPT学习教案

1、会计学1 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 第1页/共20页 佳。佳。 第2页/共20页 低电荷密度区 浓缩胶 胶孔大小，电压梯度电荷分布不均匀导致的电压梯度变化，快离子、慢离子 分离胶 Ph=6.7 Ph=8.9 电泳缓冲液由Tris 、甘氨酸、cl-、SDS组成,甘氨酸等电点=5.97 U=IR F=EQ=U/D*Q 第3页/共20页 第4页/共20页 第5页/共20页 第6页/共20页 1.材料：材料： 低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动

2、蛋白兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 根据说明书处理标准蛋白根据说明书处理标准蛋白 样品：称样品：称3mg样品，加样品，加2 ml蒸馏水溶解。蒸馏水溶解。 第7页/共20页 (1) 30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）：称）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺(交交 联剂联剂) （Bis）0.8g，加蒸馏水至，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色，过滤后置棕色 瓶瓶 4贮存可用贮存可用1-2月。月。 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠

3、） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取缓冲液：称取Tris18.2g， 加入加入50ml水，用水，用1mol/L盐酸调盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏最后用蒸馏 水定容至水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取缓冲液：称取Tris12.1g，加，加 入入50ml水，用水，用1mol/L盐酸调盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水最后用蒸馏水 定容至定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取缓冲液：称取Tris0.6g，加，加 入入50ml水，用水，用1mol/L盐酸调盐酸调pH8.0，最后用

4、蒸馏水定，最后用蒸馏水定 容至容至100ml。 第8页/共20页 第9页/共20页 第10页/共20页 分离胶分离胶(10%.10ml)浓缩胶浓缩胶(5%6ml) H2O5.2ml4.07ml Acr30%, 3.4ml30%, 1.0ml Buffer3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 1.2ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.5ml SDS已在缓冲液中加入已在缓冲液中加入（已在缓冲液里加入）（已在缓冲液里加入） 10%Ap0.10ml0.06ml TEMED10l8l 各部分凝胶配制各部分凝胶配制 第11页/共20页 1.1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将

5、玻璃板用蒸馏水洗净晾干, , 准备准备2 2个干净的个干净的 锥形瓶锥形瓶. . 2.2.把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好. . 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板坏玻璃板. . 3.3.按比例配好分离胶按比例配好分离胶, ,用移液管快速加入用移液管快速加入, ,大约大约5 5 厘米左右厘米左右, ,之后加少许蒸馏水之后加少许蒸馏水, ,静置静置4040分钟分钟. . 凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速, , 催化剂催化剂TEMEDTEMED要在注胶要在注胶 前再加入前再加入, ,否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶.

6、.注胶过程最好一次注胶过程最好一次 性完成性完成, ,避免产生气泡避免产生气泡. . 第12页/共20页 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝 空气空气 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的 界面界面. . 4.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干, ,按比例配好按比例配好 浓缩胶浓缩胶, ,连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm5mm处处, ,迅速迅速 插入样梳插入样梳, ,静置静置4040分钟分钟. . 样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入, ,梳口处不得

7、有气泡梳口处不得有气泡, ,梳底梳底 需水平需水平. . 第13页/共20页 5.5. 在上槽内加入缓冲液后在上槽内加入缓冲液后, ,拔出样梳拔出样梳。 要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出, ,否则会影响加样效果否则会影响加样效果. . 6 6、加样加样（1）取取10l标准蛋白溶解液于标准蛋白溶解液于EP管内，再加入管内，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样量为倍样品缓冲液，上样量为10l。 （2）取取10l样品溶液，再加入样品溶液，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样倍样品缓冲液，上样 量分别为量分别为5l和和3l。 7.7.用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三

8、分之一处进样, ,加样前加样前, ,样品在样品在 沸水中加热沸水中加热3 3分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳态聚合。 注射器不可过低注射器不可过低, ,以防刺破胶体以防刺破胶体, ,也不可过高也不可过高, ,在样下在样下 沉时会发生扩散沉时会发生扩散. . 为避免边缘效应为避免边缘效应, ,最好选用中部的孔注样最好选用中部的孔注样. . 第14页/共20页 8.8.电泳槽中加入缓冲液电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳接通电源，进行电泳，开始电流恒，开始电流恒 定在定在10mA，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘，溴酚蓝距凝胶边缘 约约5mm时，停止电泳。时，停止电泳。 9.9.凝胶板剥离凝胶板剥离与与染色染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板 做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。小时左右。 10.10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液 脱色，直到蛋白质区带清晰。脱色，直到蛋白质区带清晰。 剥胶时要小心剥胶时要小心, ,保持胶完好无损保持胶完好无损, ,染色要充分染色要充