色谱分离原理PPT学习教案

1、会计学1 色谱分离原理色谱分离原理 色谱法又称色层法或层析法，是一种用以分离分析色谱法又称色层法或层析法，是一种用以分离分析多组分多组分 混合物混合物的极有效的物理及物理化学方法。的极有效的物理及物理化学方法。 经典色谱法经典色谱法 Chromatography 1905年俄国植物学家年俄国植物学家M.G. 茨维特茨维特 柱色谱、纸色谱柱色谱、纸色谱 薄层色谱薄层色谱 Michael Tswett(1872-1919), a Russian botanist , discovered the basic principles of column c h r o m a t o g r a p

2、h y. H e separated plant pigments by eluting a mixture of the pigments on a column of calcium carbonate. The various pigments separated into colored bands; hence the name chromatography. 石油醚石油醚 第1页/共30页 现代色谱法现代色谱法 1952年气相色谱分析法年气相色谱分析法 National Institute for Medical Research London, United Kingdom Ma

3、rtin AJP Rowett Research Institute Bucksburn (Scotland), United Kingdom Synge RLM 第2页/共30页 第3页/共30页 第4页/共30页 第5页/共30页 第6页/共30页 年代年代发明者发明者发明的色谱方法或重要应用发明的色谱方法或重要应用 1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱色谱概念。概念。 1931Kuhn, Lederer 用氧化铝和碳酸钙分离用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和和g-胡萝卜素。胡萝卜素。 1938Izmailov, Shraibe

4、r最先使用最先使用薄层色谱薄层色谱法。法。 1938Taylor, Uray用用离子交换色谱法离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。分离了锂和钾的同位素。 1941Martin, Synge 提出色谱提出色谱塔板理论塔板理论；发明液；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动液分配色谱；预言了气体可作为流动 相（即气相色谱）。相（即气相色谱）。 1944Consden等等发明了发明了纸色谱纸色谱。 1949Macllean氧化铝中加淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。氧化铝中加淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。 1952Martin, James从理论和实践方面完善了从理论和实践

5、方面完善了气气-液分配色谱液分配色谱法。法。 1956Van Deemter等等提出色谱提出色谱速率理论速率理论，并应用于气相色谱。，并应用于气相色谱。 1957 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 1958Golay发明发明毛细管柱气相色谱毛细管柱气相色谱。 1959Porath, Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。发表凝胶过滤色谱的报告。 1964Moore发明发明凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱。 1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 1975Small 发明了以离

6、子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型 电导检测的新型电导检测的新型离子色谱法离子色谱法。 1981Jorgenson等等创立了创立了毛细管电泳法毛细管电泳法。 第7页/共30页 年代年代获奖学科获奖学科获奖研究工作获奖研究工作 1937化学化学类胡萝卜素类胡萝卜素化学，化学，维生素维生素A和和B 1938化学化学类胡萝卜素化学类胡萝卜素化学 1939化学化学聚甲烯和高萜烯化学聚甲烯和高萜烯化学 1950生理学、医学生理学、医学性激素性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离化学及其分离、肾皮素化学及其分离 1951化学化学超铀超铀元

7、素的发现元素的发现 1955化学化学脑下腺激素脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素的研究和第一次合成聚肽激素 1958化学化学胰岛素胰岛素的结构的结构 1961化学化学光合光合作用时发生的化学反应的确认作用时发生的化学反应的确认 1970生理学、医学生理学、医学关于关于神经元触处迁移物质神经元触处迁移物质的研究的研究 1970化学化学 糖核苷酸糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物的发现及其在生物合成碳水化合物 中的作用中的作用 1972化学化学核糖核酸化学酶结构核糖核酸化学酶结构的研究的研究 1972生理学、医学生理学、医学抗体结构抗体结构的研究的研究 第8页/共30页 色谱法色谱法(chr

8、omatography)以试样组分在以试样组分在固定相固定相 和和流动相流动相间的间的溶解、吸附、分配、离子交换溶解、吸附、分配、离子交换或其他或其他亲和亲和 作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法。作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法。 色谱法色谱法 分离科学分离科学 (理论理论+技术技术) (分离分离+分析分析) 现代分离科学是分析化现代分离科学是分析化 学中发展最快、应用最学中发展最快、应用最 广、潜力最大的领域之广、潜力最大的领域之 一。一。 第9页/共30页 色谱法色谱法 气体气体 超临界流体超临界流体 气固色谱气固色谱 （GSC） 气液色谱气液色谱 （GLC） 超临界

9、流体色谱超临界流体色谱 (SFC) 胶束电动色谱胶束电动色谱 （MEKC） 液液色谱液液色谱 （LLC） 吸附色谱吸附色谱 （LSC） 尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱 (SEC) 键合相色谱键合相色谱 (BPC) 离子交换色谱离子交换色谱 (IEC) 亲和色谱亲和色谱 (AC) 毛细管电色谱毛细管电色谱 (CEC) 液固色谱液固色谱 （LSC） 液体液体 第10页/共30页 第11页/共30页 固定相固定相 流动相流动相 A+B+C 洗脱法洗脱法 elution 前沿法前沿法frontal analysis 置换法置换法displacement C B A A+B+C A+B A A B C B+C

10、 A+B C B A A AB ABC A AB B C BC 分析型色谱分析型色谱 方便方便 制备色谱制备色谱 工业流程色谱工业流程色谱 固相萃取固相萃取 样品为流动相或样品为流动相或 流动相的一部分流动相的一部分 置换剂为流动相置换剂为流动相 第12页/共30页 基本关系：基本关系： 保留值：保留值：反映溶质与固定相作用力的大小，是色谱反映溶质与固定相作用力的大小，是色谱定性分定性分 析析和色谱过程和色谱过程热力学热力学特征的重要参数。对保留值的研究能揭示特征的重要参数。对保留值的研究能揭示 色谱过程的色谱过程的作用机理作用机理和分子（溶质、固定相、流动相）的和分子（溶质、固定相、流动相）

11、的结构结构 特征特征。 )( )( )( )( sR iR sR iR is V V t t r 相对相对保留值保留值 relative retention m s c c K 分配系数分配系数 distribution coefficient mm ss Vc Vc k 容量因子或分配比容量因子或分配比 capacity factor m s V V Kk M R M R V V t t k K, k均热力学参数，均热力学参数，k还和柱性质有关还和柱性质有关 。 第13页/共30页 A T B kln 气相色谱保留值方程气相色谱保留值方程： （是气相色谱保留值变化最基本的规律）（是气相色谱保

12、留值变化最基本的规律） 通过通过改变改变T实现分实现分 离、改变选择性离、改变选择性 和调节保留值和调节保留值 11 lnCnAk 同系物碳数规律方程同系物碳数规律方程： 说明说明同系物同系物的保留随的保留随 分子量、沸点、蒸汽分子量、沸点、蒸汽 压增加而增加，是保压增加而增加，是保 留值留值定性定性的基础的基础 第14页/共30页 液相色谱保留规律液相色谱保留规律 液相色谱保留值方程液相色谱保留值方程： B CcAkln cB为流动相中有机相为流动相中有机相 浓度，浓度，C0, 即即容量容量 因子随因子随cB增加而减少增加而减少 1. 二元溶剂反相色谱：二元溶剂反相色谱： 但蛋白质和多肽空间

13、结构随溶剂疏水性而改变，其保留值但蛋白质和多肽空间结构随溶剂疏水性而改变，其保留值 呈非线性变化呈非线性变化 i Bi i cCAk ln 2. 多元溶剂反相色谱：多元溶剂反相色谱： 近似式近似式 第15页/共30页 液相色谱保留值方程液相色谱保留值方程： 液相色谱保留规律液相色谱保留规律 3. 二元溶剂正相色谱：二元溶剂正相色谱： BB CccBAklgln 正相色谱固定相是正相色谱固定相是多孔硅胶多孔硅胶和和极性键合相极性键合相，流动相是，流动相是己烷己烷和和 有机相（乙醚、异丙醇等）混合液。有机相（乙醚、异丙醇等）混合液。 i BB i i ii CccBAklgln 4. 多元溶剂正相

14、色谱：多元溶剂正相色谱： 近似式近似式 第16页/共30页 液相色谱保留规律液相色谱保留规律 柱温：柱温：影响影响分离选择性分离选择性、流动相黏度流动相黏度、分离速度分离速度和和柱前压柱前压。 温度温度，溶剂黏度，溶剂黏度，分析速度，分析速度，选择性，选择性； 但但柱寿命柱寿命；一般为；一般为室温室温至至60，ZrO2基质柱可达基质柱可达150 碳 数 规 律 ：碳 数 规 律 ：反相反相LC中中，同系物，同系物CH2，与固定相的，与固定相的C18等碳链分子间作用等碳链分子间作用， 与流动相溶剂分子作用也会与流动相溶剂分子作用也会，因色散作用为主，故保留值，因色散作用为主，故保留值，和和 GC

15、碳数规律相同碳数规律相同。 正相正相LC中，中，负碳数规律负碳数规律。 溶 液 酸 度 ：溶 液 酸 度 ：酸、碱性和两性化合物酸、碱性和两性化合物，溶液，溶液pH变化影响分子解离平衡，变化影响分子解离平衡，RP- HPLC中，中，中性分子有效保留中性分子有效保留。流动相。流动相pH为化合物为化合物pKa时保留时保留 值重现性最差，选择色谱条件时应避开。值重现性最差，选择色谱条件时应避开。 不能解离的中性分子不能解离的中性分子保留值不受保留值不受pH变化的影响。变化的影响。 第17页/共30页 固定相性质固定相性质： 填料孔径填料孔径，表面积，表面积，吸附位点，吸附位点，保留，保留 保留值对吸

16、附剂表面积增加呈线性增加。保留值对吸附剂表面积增加呈线性增加。 分离小分子填料孔径为分离小分子填料孔径为6.0-12.0nm，表面积，表面积300-800m2/g。 分离蛋白质和多肽，孔径分离蛋白质和多肽，孔径30.0nm，表面积，表面积100m2/g 键合量键合量，保留值，保留值，键合达一定程度（含碳率，键合达一定程度（含碳率15%） 保留达到饱和。保留达到饱和。 键合碳链长度键合碳链长度：RP-HPLC中中C18键合相对多数有机化合键合相对多数有机化合 物有较强保留，物有较强保留，应用广泛应用广泛；但对；但对强疏水性化合物强疏水性化合物如多环芳如多环芳 烃类，纯甲醇洗脱时保留值也较大，选烃

17、类，纯甲醇洗脱时保留值也较大，选C8、C4、C2、C1 柱调节保留值和选择性，实现不同类型化合物快速有效的柱调节保留值和选择性，实现不同类型化合物快速有效的 分离。分离。 在完全相同的条件下，在完全相同的条件下，化合物的保留值随键合相碳链化合物的保留值随键合相碳链 加长而增大加长而增大。 第18页/共30页 样品保留值相差很大时，恒定样品保留值相差很大时，恒定 GC温度温度 LC流动相组成流动相组成 SFC密度密度 结果结果 不好！不好！ 因因GC中，中，tR与溶质沸点近于与溶质沸点近于 指数关系，如组分沸点超过指数关系，如组分沸点超过 100，用折中温度很难完全用折中温度很难完全 分离；分离

18、； LC和和SFC中，溶质与固定相中，溶质与固定相 亲和力相差较大时，恒定组亲和力相差较大时，恒定组 成流动相或恒定密度超临界成流动相或恒定密度超临界 流体，难以洗脱。流体，难以洗脱。 色谱洗脱普遍性问题色谱洗脱普遍性问题 特征：特征：分离时间长，分离时间长， 先出峰者分离效果差，先出峰者分离效果差， 后出峰者谱带展宽。后出峰者谱带展宽。 程序化模式！程序化模式！ 第19页/共30页 色谱色谱 程序化参数程序化参数程序化模式程序化模式说明说明 GC温度、流速温度、流速程序升温程序升温 流速程序化只适合流速程序化只适合 于低温热不稳定化于低温热不稳定化 合物分离合物分离 LC 流动相组成流动相组

19、成 流速、温度流速、温度 梯度洗脱梯度洗脱 温度程序化只适合温度程序化只适合 于小内径轻质微柱于小内径轻质微柱 SFC 密度、组成密度、组成 温度温度 密度密度（单一溶剂）、（单一溶剂）、 流动相组成流动相组成（混合溶（混合溶 剂）、温度程序化剂）、温度程序化 第20页/共30页 色谱谱带色谱谱带（band）或区带或区带（zone）: 描述试样各组分在描述试样各组分在 色谱柱内色谱柱内差速迁移差速迁移和和分子扩散分子扩散形成的浓度分布。形成的浓度分布。 间接反映出组分在柱内的运行情况。间接反映出组分在柱内的运行情况。 谱带展宽谱带展宽样品各组分谱带会样品各组分谱带会变宽变宽且且变宽的幅度变宽的

20、幅度与其在色与其在色 谱柱上的谱柱上的保留时间成正保留时间成正比。比。 原因：原因：色谱分离过程中各种色谱分离过程中各种动力学动力学因素引起。因素引起。 色谱峰形：色谱峰形：色谱峰的色谱峰的宽度宽度和和对称性对称性。多种动力学因素造成峰。多种动力学因素造成峰 形拖尾而不对称。形拖尾而不对称。 第21页/共30页 22 2/ ) (16) (54. 5 w t w t n R h R eff Heff=L/neff 峰底宽峰底宽： W = 4=1.70 Wh/2 Wh/2=2.355 半高峰宽半高峰宽： H=L/n 理论塔板高理论塔板高： 2 )(16 W t n R 2 2 )(54. 5 h

21、 R W t n 理论塔板数理论塔板数： 塔板理论塔板理论 第22页/共30页 应用：应用：用于描述色谱分离效率的特征参数用于描述色谱分离效率的特征参数n、H。 缺陷：缺陷：其假设与实际色谱过程相差较大：其假设与实际色谱过程相差较大： 每个塔板内分子纵向扩散可以忽略，而分子扩散是引每个塔板内分子纵向扩散可以忽略，而分子扩散是引 起谱带展宽的主要因素；起谱带展宽的主要因素； 溶质在各塔板上分配系数是常数，而分配系数与溶质溶质在各塔板上分配系数是常数，而分配系数与溶质 浓度有关；浓度有关； 流动相不连续流动；流动相不连续流动； 不能用填料性质和形状、柱参数、流动相种类和流速不能用填料性质和形状、柱

22、参数、流动相种类和流速 解释谱带展宽。解释谱带展宽。 被速率理论所取代被速率理论所取代 第23页/共30页 速率理论：速率理论：组分单个粒子在色谱柱内固定相和流动相间发组分单个粒子在色谱柱内固定相和流动相间发 生千万次转移，加上分子扩散和运动途径等因素，它在柱内的生千万次转移，加上分子扩散和运动途径等因素，它在柱内的 运动运动随机随机、高度、高度不规则不规则，随流动相前进的速度不均一。，随流动相前进的速度不均一。 涡流扩散项涡流扩散项A： 为填充不均匀性因子，为填充不均匀性因子，dp为粒径为粒径 Cu u B AH u D d k k D d k k u D d g p l fg p ) )1

23、 ( 01. 0 )1 (3 2 ( 2 2 2 2 2 2 2 范弟姆特（范弟姆特（Van Deemter）方程）方程 分子扩散项分子扩散项B/u(纵向扩散项纵向扩散项)： 为扩散阻碍因子，为扩散阻碍因子，气体扩散系气体扩散系 数数) 1 ( 载气载气 M Dg 传质阻力项传质阻力项Cu： df为液膜厚度，为液膜厚度，Dg为溶质在固定相中扩散系数为溶质在固定相中扩散系数 流动相线速度流动相线速度u: H-u为双曲线，有极值为双曲线，有极值uopt 第24页/共30页 结论：结论：对对LC： 可可减小填料粒径减小填料粒径、高柱压操作高柱压操作、使用、使用低黏度流动相低黏度流动相来达到好的来达到

24、好的 分离效果。分离效果。 第25页/共30页 )WW( )tt (2 )WW( 2 1 tt R 21 1r2r 21 1r2r 分离度：分离度：定量描述相邻两组分在色谱柱内分离情况的指标。定量描述相邻两组分在色谱柱内分离情况的指标。 R=1，基本分离基本分离；R=1.5，完全分离完全分离 1 1 4 2 2 k kn R 1. k很小时，很小时，R随随k的增加而迅速增加，的增加而迅速增加，k10时，时，k增加，而增加，而R 变变 化很小，一般改变固定相或流动相调节化很小，一般改变固定相或流动相调节1k10; 2. =1，不能分离；，不能分离；略大于略大于1，可能分离；，可能分离；=2，容易分离；，容易分离； GC通过选择固定相和降低柱温，提高通过选择固定相和降低柱温，提高；LC通过改变固定通过改变固定 相和流动相性质提高相和流动相性质提高。 3.