色谱法的基本原理PPT学习教案

1、会计学1 色谱法的基本原理色谱法的基本原理 2.1 概 述 2.1.1 色谱法发展史 色谱法是俄国植物学家Tswett（茨维特）于1903年首先 提出的。他把植物色素的石油醚抽提液倒入一根装有固体 碳酸钙颗粒（固定相）的竖直玻璃管（色谱柱）中，并再 从管的上部加入纯的石油醚（流动相），任其自由流下。 这时植物色素的抽提液沿玻璃管流动，在管内形成具有不 同颜色的色带，每个色带代表不同的组分。 - “色谱”（色层）因而得名 第1页/共38页 第2页/共38页 色谱法：借助在两相间分配系数的差异，而使混合物中各 组分获得分离的技术称为色谱分离技术。 固定相：填充柱内的填料（固体或液体）。 流动相：携

2、带样品流过固定相 (气体、液体和超临界流体) 。 色谱柱：装有固定相的柱。 色谱分离过程：当流动相中携带混合物经过固定相时，与固定 相发生作用，由于各组分的结构性质（溶解度、极性、蒸汽压 和吸附能力等）不同，这种相互作用产生强弱的差异。在同一 推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，按先 后不同的次序从固定相中流出。 几个基本术语： 第3页/共38页 气相色谱 液相色谱 液-固 色谱 气-液 色谱 第4页/共38页 柱色谱：固定相装在柱管内。它又可分为填充柱色 谱和毛细管柱色谱。固定相装在色谱柱（玻璃管或毛细 管）内。 纸色谱：用滤纸作固定相或载体，把试样液体滴在 滤纸上，用溶剂将它

3、展开，根据其在纸上有色斑点的位 置与大小，进行鉴定与定量测定。 薄层色谱：将固定相研磨成粉末，再涂敷成薄膜。 样品的分离形式类似纸色谱。 第5页/共38页 在液-液分配色谱中，根据流动相和固定相相对极 性不同，又分为正相分配色谱和反向分配色谱。 固定相是一种分子筛或凝胶，利用各 组分的分子体积大小不同而进行分离的方法。 ：利用不同组分与固定相的高专属性亲合力进行分离 的技术，常用于蛋白质的分离。 第6页/共38页 色谱法的分类大致如下： 根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表中： 第7页/共38页 m s C C K K V V K VC VC n n m m k m s mm ss m s

4、m s s m V V ：相比 第8页/共38页 进样 AB空气 BAA+B 流动相 B B A 流动相 固定相 检测和纪录 第9页/共38页 色谱流出曲线（色谱图）即色谱柱流出物通过检 测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵 坐标为信号强度，横坐标为保留时间。 峰高 色谱峰 保留时间（分） 响应值 第10页/共38页 第11页/共38页 1、 有关术语 第12页/共38页 死时间tm : 不被固定相吸附或溶解的组分进入色谱 柱时，从进样到柱后出现浓度最大值所需的时间。 对于气相色谱，常把空气(TCD)和甲烷(FID)从进样 到出峰的时间称为tm。如图中O-A。这种物质不被 固定相吸附或溶

5、解，其流速与流动相的流速接近。 测定流动相平均线速度 时可用柱长L与死时间tm 的 比值计算。 m L u t m L t u 2、 保留值 第13页/共38页 第14页/共38页 从进样开始到柱后被测组份出从进样开始到柱后被测组份出 现浓度最大值时所通现浓度最大值时所通 过的流动相体积。如下：过的流动相体积。如下： VR = tRF0 第15页/共38页 222 2 1 111 RRR , RRR tVt tVt 调整保留体积VR 某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积 VR= tRF0 或 VR = VR - Vm 相对保留值2,1 某组份2与组份1的调整保留值之比，是一个无

6、因次量。 2,1的大小与两组分的选择性有关。2,1越大，选择性越好 ，越容易分离。2,1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱 径、柱长、填充情况及流动相流速无关。因此是色谱法中 ，特别是气相色谱法中广泛使用的定性数据。 第16页/共38页 根据色谱峰个数，可以判断样品中所含组份的最少个 数。 根据色谱峰的保留值（或位置），可以进行定性分析 。 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析。 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效 能的依据。 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择 是否合适的依据。 第17页/共38页 在每块塔板上气液平衡是瞬间建立的。 载气以脉冲式(塞子式)进入色

7、谱柱进行冲洗，每次恰好为一个塔 板体积。 在所有塔板上同一组分的分配系数是常数，和组分的量无关。 柱分成几段，n为理论塔板数，每段高为H，柱长为L，n=L/H。 第18页/共38页 0.5 0.5 0.250.25 0.250.25 0.1250.250.125 0.12550.250.125 0.06250.1880.1880.0625 0.06250.1880.1880.0625 0.031250.1250.1880.1250.03125 0.031250.1250.1880.1250.03125 w=1g 1V 2V 3V 4V 第19页/共38页 这一理论得到结果： 1分布有一最大，两

8、边逐渐减小； 2最大及整个分布曲线向后推移； 3流出曲线方程 (也称塔板理论方程)，即数学表达式： 2 R 2 R R () 2 2 Ce N VV N m V V C：不同流出体积时的组分浓度 m：进样量 VR：保留体积 N：塔板数 V ：流出体积 S V(t,x) 被测物流出色谱柱时流动相中被测物浓度随体积(或时间)的变 化曲线： 第20页/共38页 L H N 2 16 R t N Y 色谱峰W 越小，N 越大，H 越小，柱效能越高。因此，N 和H 是描述柱效能的指标。 在实际工作中，计算出来的N 和H 值时,有时并不能充分 地反映色谱柱的分离效能，因为用tR计算时，没有扣除死 时间tm

9、，应予扣除。所以用tR代替tR 计算出来的N 值称 为有效理论塔板数Neff。 第21页/共38页 22 1 2 5 5416 RR eff / .()() tt N YY 有效塔板高度： 根据tR= tR- tm，k = tR/ tm ，tR = tm(1+k)，可得 eff eff L H N 2 eff 1 k NN + k 第22页/共38页 塔板理论的成功与局限 成功 导出流出曲线数学表达式(模型)； 解释了流出曲线形状、浓度极大点； 提出了评价柱效的参数(N)及其计算公式。 局限 仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素； 不能说明影响柱效的原因及谱带扩张的原理； 不能说明流速对柱效

10、的影响，实验测得流速不同时N 和H不同。 速率理论 第23页/共38页 1956年荷兰化学家Van Deemter等在研究气-液色谱时 ，讨论扩散传质等与色谱过程物料平衡和质量平衡的关 系，考察溶质通过色谱体系总浓度的变化。他提出了色 谱过程动力学理论速率理论。随后Giddings吸收了塔 板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩 散和传质过程，认为把色谱过程看作分子无规则运动的 随机过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高 的各种因素。 第24页/共38页 B H = A+Cu u 式中： u为流动相的线速度； A，B，C为常数 A涡流扩散项系数 B纵向分子扩散项系数 C传质阻力

11、项系数（ C C s C m)。其中C s： 固定相传质阻力项系数； C m：流动相传质阻力项系数 。第25页/共38页 A B 第26页/共38页 分子扩散项B/u 第27页/共38页 Cgu -气相传质阻力项；Cg-气相传质阻力系数; Clu -液相传质阻力项； Cl-液相传质阻力系数 C u = Cg u + Cl u (Cg+ Cl )u 气相传质过程：气相传质阻力项与填充物粒度的平方成正 比，与组分在载气流中的扩散系数成反比，因此采用粒度 小的填充物和分子量小的气体作载气可提高柱效。 液相传质过程：减小液膜厚度，增大组分在液相中的扩散 系数，均可提高柱效。 第28页/共38页 被分离

12、组分分子在色谱柱内运行的多路径、浓度梯度 所造成的分子扩散及传质阻力使气-液两相间分配平衡不能 瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因 。 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及 载气流速可提高柱效。 速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指 导，阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的 影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大， 又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子 扩散的影响。因此，选择最佳条件，才能使柱效达到最高 。 第29页/共38页 第30页/共38页 一、定义 分离度是两色谱峰分离的程度。

13、图中： a）两色谱峰距离近并且峰形宽。 两峰严重相叠，表示选择性和柱 效都很差。 b）两峰距离拉开，但峰形仍很宽 ，说明选择性好，但柱效低。 c）分离最理想，说明选择性好， 柱效也高。 第31页/共38页 tR（2） ，tR（1） ：两组分保留时间 Y 1，Y2 ：两组分色谱峰峰底宽度 分离度Rs 单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情 况，故需引入一个综合性指标。分离度是既能反映柱效率 又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫 分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分 色谱峰底宽总和之半的比值。 1 2 2121 12 12 ) ) 2( ( RRRR ttt

14、t R YY YY 第32页/共38页 同一色谱柱在相同条件下，不同组分可有不同的Rs值。 若峰形对称且满足正态分布条件，当 Rs = 1时，分离程度 可达到98%； Rs = 1.5时，分离程度可达到99.7%，通常用 Rs = 1.5作为相邻两色谱峰完全分开的标志。 两个相邻组分达到完全分离的条件： （1）两色谱峰间有一定距离； （2）两色谱峰宽必须窄。 Rs = 0.75Rs = 1.0Rs = 1.5 第33页/共38页 s 2121 122 ) 1 1 2( 4 RRRR k k tttt N R YYY Y1 = Y2 二、色谱分离方程式及影响分离度的因素 两个相邻组分达到完全分离

15、的条件： 两色谱峰间有一定距离，热力学因素。 两色谱峰宽必须窄，动力学因素。 在色谱分析中，一般选一对难分离物质确定分离度。 对于难分离物质对，近似把两组分峰底宽看成一样。 2 2 222 1 ()16() () () 111 16() 1 = = = 2 2 s s eff eff kk k R kk R k NN N 第34页/共38页 N (1) 色谱柱效 N Rs与成正比。当固定相确定后，要使相邻组分的分 离达到某一Rs值，柱必须具有最低限度理论塔板数。 柱效相: 反映柱效率对Rs的作用； 分配比相：反映分配比对Rs的作用; 分离相或选择性：反映分离效率对Rs的作用. 调节方法：增加柱长L、减小塔板高度H。 Rs的定义没有反映影响分离度的诸因素。Rs是柱效N、选择因 子和容量因子k三个参数的函数。和k的大小取决于色谱系 统与物质对的热力学性质，N取决于色谱系统的动力学性质。 第35页/共38页 Rs正比于 k / k+1，k 增大，Rs增加，最佳k值