GDNFmRNA、GFR.α1mRNA在不同年龄大鼠SVZ和海马表达的变化及其意义(一).doc

1、GDNFmRNA、GFR. 1 mRNA在不同年龄大鼠SVZ和海马表达的变化及其意义 (一)作者：刘方舟，杨宁，朱岩，曾水林，潘秋辉，刘云龙摘要目的:观察不同年龄SD 大鼠脑室管膜下区（SVZ）和海马GDNFmRNA及其受体 GFR. 1mRNA表达水平的变化，探讨其在神经发生及脑老化中的作用。 方法 :用 RT.PCR方法检测胚胎 18d、新生以及 1、3、8、12 月龄 SD大鼠 SVZ和海马 GDNFmRNA及其受体 GFR. 1mRNA的变化。结果 :随着年龄增长， SD大鼠 SVZ和海马 GDNFmRNA及其受体 GFR.1mRNA表达水平逐渐降低。且各年龄组海马表达参数的幅度小于

2、SVZ。结论 :GDNF及其受体 GFR.1在神经发育及脑老化进程中起到一定的作用。关键词脑室管膜下区 ;海马 ;胶质细胞源性神经营养因子 ;胶质细胞源性神经营养因子受体 . 1;大鼠近年来神经科学研究的一项重要进展是，发现成年哺乳动物脑内某些特定区域在正常状态下存在神经发生现象。其中脑室管膜下区（ subventricularzone， SVZ）和海马颗粒下层（ subgranularlayerzone，SGZ）已被证实是神经前体细胞产生最为活跃的区域1，2。成年脑的神经发生现象局限于特定的脑区，提示相关生发脑区的微环境可能对神经发生起着重要作用。也有的研究证明微环境的变化与脑老化的过程相关

3、。脑的神经发生与脑老化有可能就是微环境变化影响神经前体细胞的结果。神经生长因子是目前研究最多的调节因子，在体内外，EGF、FGF、IGF.1等均可刺激 SVZ细胞增殖，甚至可以调节神经前体细胞的定向分化 3，4。转化生长因子 . （transforminggrowthfactor. ， TGF.） 超 家 族 成 员 的 胶 质 细 胞 源 性 神 经 营 养 因 子（ glialcellline-de-rivedneurotrophicfactor ，GDNF）是现有神经营养因子作用最强的一种 5，因其广泛的神经营养作用及潜在的促神经前体细胞分化作用而成为近年来的研究热点。GDNF 的受体由

4、固定于质膜外层的糖基磷脂酰肌醇（GPI），称为 GDNF家族受体 1-4（GDNFfamilyrecep-tor 1-4，GFR.1-4）和 GDNF功能性受体孤儿酪氨酸 RET蛋白（由原癌基因 C.RET编码）所组成。当 GDNF 结合于 GFR.（主要高亲和性地结合于 GFR.1）时，通过招募 RET蛋白形成受体复合物激活下游信号转导途径， 从而产生生物学效应 6。另外研究发现， 缺乏 RET时，GDNF通过激活 GFR.1相关 Src蛋白样激酶途径进行信号转导 7，故 GDNF 信号转导途径具有依赖和不依赖RET蛋白两种方式，而GFR.1是两者的关键信号转导分子。现在已知中枢神经系统的可

5、塑性和修复能力随年龄的增加而下降，神经发生现象也随年龄增加而降低，但作为具有广泛的神经营养作用及潜在的促神经前体细胞分化作用的GDNF及其受体 GFR.1，在不同年龄大鼠的表达水平是否与神经发生有关 ?其增龄变化目前还不是很清楚，尤其从分子水平研究 GDNF及其受体的增龄性变化尚未见报道。 本研究采用 RT.PCR方法观察了不同年龄大鼠 GDNF 及其受体 GFR.1在SVZ、海马的表达变化，探讨其在神经发生及脑老化进程中的生物学意义。1 材料与方法1.1 材料RNA抽提试剂盒 TrizolReagent（Gibco），RT.PCR试剂盒（ TaKaRa），Tris碱、溴酚蓝、 EB、EDTA

6、、琼脂糖， SDS（上海生工生物工程公司） ，DEPC（Fluka 公司），DNA 分子质量标准 DNAMarkerDL2000（TaKaRa）。GDNF分子引物序列 :上游引物5.GACTCCAATGTGCCCGAAGA，.下3游引物5 .CCTACCTTGTCACTTGCTAGCC，该.3引物产生394bp 的 cDNA 片段;GFR.1分子引物序列 :上游引物 5.CTGGAAAGATGAACCGATTG，.3下游引物 5.CTCTGTGAGAGGGTGAGAAG，该.3引物产生 290bp 的 cDNA片段。上述引物由作者潘秋辉设计。.actin分子引物序列 :上游引物5 .ATGCC

7、ATCCTGCGTCTGGACCTGGC.3， 下 游 引 物5.AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG，该.3引物产生 603bp 的 cDNA 片段，上述引物序列由上海生工生物工程公司合成。1.2 动物分组与取材SD大鼠每组 4 只，分为孕 18d（取胚胎）、新生以及 1、3、8、12 月龄 6 组（由中山大学第二附属医院实验动物中心提供） 。孕 18d 组大鼠以0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在体视显微镜下取出胚胎，快速分离胚胎大脑组织，显微镜下分离侧脑室周围区域与海马，用0.01mol?L-1PBS液洗净血液，快速匀浆，置于液氮中保存备用。其余5 组大鼠以 0.4%戊巴比妥

8、钠腹腔注射麻醉，按Swanson大鼠脑图谱 8，于坐标 bregma+1.45、bregma+0.45 处进行定位，快速断头、剥离侧脑室周围区域（切取双侧侧脑室外侧壁自室腔面向外侧，其厚度约为1.0mm）9与海马组织，用 0.01mol? L1PBS液洗净血液，快速匀浆，置于液氮中保存备用。1.3RNA抽提、 RT反应及 PCR扩增过程1.3.1 大鼠 SVZ、海马组织 RNA的抽提分别取 50100mg 脑室管膜下区和海马冻存脑组织，采用Trizol 一步法获得 RNA，RT和 PCR反应过程前取少量作紫外扫描分析和琼脂糖电泳分析。1.3.2RT反应在无 Rnasin的离心管中依次加入总RN

9、A2l和 DEPC处理水7.5 l，99变性 5min，冰浴 5min，然后加入终浓度为5mmol? L-1 的MgCl24l、1 RTbuffer2、1mmol?l L-1 的 dNTP2l、20U 的 rnasin0.5 、l15U 的 RT1l、Oligo（dT15）1l，42水浴 45min，99水浴 5min，然后冰浴 5min，产物置于 -20保存备用。1.3.3PCR扩增在 0.5ml 的薄壁离心管中依次加入 RT产物 2l、25mmol ? L-1 的 MgCl22l、10buffer4 、l终浓度为 0.2mmol? L-1 的 dNTP、 30 mol? L-1 的 Pri

10、mer（GDNF、GFR.1）.2 l、1U? l-1的 Taq酶 1.5 l、DEPC处理水 31.3 l、石蜡油 50l，瞬时离心后于 94反应 7min，然后在 941min、541min 、721min 下反应 35 个循环，最后在 72下反应 10min。产物于 4下保存备用。 .actin扩增反应同上述步骤，用作 RT.PCR检测基因表达时的阳性对照。1.4PCR产物检测与数据处理PCR产物 10l上样于含溴化乙锭的 2%琼脂糖凝胶，电压降为 5V? cm-1，凝胶扫描系统进行密度扫描后， 以对应组 .actin密度为 100%对照校正，用凝胶图像分析系统（ leica）进 行扩增产物半定量分析，得到GDNFmRNA、GFR. 1mRNA的光密度值，结果以 xs表示，用 t 检验比较各组标本差异的显著性。2 结果2.1 不同年龄大鼠 SVZ、海马总 mRNA 分析在 1%琼脂糖凝胶电