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1、原生质体融合再生柑橘原生质体融合再生柑橘 种间二倍体体细胞杂种种间二倍体体细胞杂种 柑橘遗传上高度杂合柑橘遗传上高度杂合, ,且大多数柑橘主栽品种具有多胚性且大多数柑橘主栽品种具有多胚性, ,使有性杂交较使有性杂交较 难获得杂种难获得杂种, ,原生质体融合是克服上述困难的有效途径之一。采用电原生质体融合是克服上述困难的有效途径之一。采用电 场诱导融合方法场诱导融合方法, ,诱导丹西红橘愈伤组织原生质体和红江橙叶肉原生诱导丹西红橘愈伤组织原生质体和红江橙叶肉原生 质体融合质体融合, ,获得了再生植株。获得了再生植株。 再生植株在叶片形态上与叶肉亲本红江橙完全一样再生植株在叶片形态上与叶肉亲本红江

2、橙完全一样, ,苏木精染色法表苏木精染色法表 明再生植株具有明再生植株具有2 2 条染色体条染色体, ,为二倍体。采用为二倍体。采用 个个21 21 碱基随机引碱基随机引 物鉴定再生植株的杂种特性物鉴定再生植株的杂种特性, ,只有只有0 0 个引物能将融合亲本区分开个引物能将融合亲本区分开, ,再生再生 植株的带型在一个引物中与叶肉亲本一致植株的带型在一个引物中与叶肉亲本一致, ,在另一个引物中则具有愈在另一个引物中则具有愈 伤组织亲本的特异带伤组织亲本的特异带, ,表明通过电场诱导融合法得到了丹西红橘和红表明通过电场诱导融合法得到了丹西红橘和红 江橙种间二倍体杂种植株。江橙种间二倍体杂种植株

3、。 一一 综述综述 一一 试验方法试验方法 2 2、原生质体分离和纯化、原生质体分离和纯化 3 3、原生质体融合、原生质体融合 融合方式为电场诱导融合融合方式为电场诱导融合, ,融合条件参考以前的方法。融合条件参考以前的方法。 参数为参数为: :交流电场强度交流电场强度75V/cm75V/cm，作用时间，作用时间60s,60s,直流电场强度直流电场强度1000-1000- 2000V/cm2000V/cm，5 5次脉冲次脉冲, ,间隔时间间隔时间1s1s。直流电场处理后。直流电场处理后, ,静置静置20-30min20-30min， 使融合子能够充分圆球化。使融合子能够充分圆球化。800r/m

4、in800r/min离心离心5min,5min,沉淀后的原生质体用沉淀后的原生质体用 BHBH，培养基悬浮至，培养基悬浮至500000mL500000mL。 电场诱导融合过程短,融合体培养后,在10-15d可以观察到有原生 质体发生第一次分裂20天左右即能观察到多细胞团，到1个月时细 胞团长到肉眼可见的小愈伤组织40d 时将愈伤组织转到EME培养基 中,迅速长大,并有愈伤组织转变为绿色的胚状体。将胚状体转入 EME培养基进一步生长,就观察到从子叶期胚状体上长出从芽。本组 合再生的丛芽较多,生长势好,但再生丛芽的生根能力不强。切下的 丛芽转入生根培养基后,只有部分能长出根,大多数不能生根,而且 生根所需时间也

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