免疫测定方法学和临床应用

1、1 2 l免疫分析技术简介 l乙肝病毒标志物定性、定量检测常见问题 l抗HCV检测问题 l检测问题 lTP-Ab检测问题 lTB-Ab检测问题 3 l早期的免疫分析技术早期的免疫分析技术: 免疫扩散、免疫电泳、直接及间接血凝、被动 血凝、补体结合实验 l特点:这些检测方法成本低、结果易于判断、技 术上便于掌握,但不便于免疫检测自动化 l后来的免疫分析技术后来的免疫分析技术: 放射性核素标记、荧光免疫标记、酶免疫标记、 稀土元素标记及化学发光分子标记 l特点:快速、灵敏、特异、易于测定等实验室的 免疫检测自动化奠定了基础 4 待测物质浓度与检测手段待测物质浓度与检测手段 临床化学分析临床化学分析

2、 10 -12 10 -9 10 -6 10 -3 10 -0 pg/mLng/mLm mg/mLmg/mLg/L 免疫分析免疫分析 Therapeutic Drugs Thyroid Hormone Fertility Hormone Allergy Cancer Markers Infectious Disease Vitamins Serum Proteins 免疫分析技术 5 l1959 美国Yalow ; 第二代试剂除上述第二代试剂除上述C C100 100抗原外又 抗原外又加上了加上了HCV核心核心 区区多肽多肽C C22-3 22-3和非结构区抗原 和非结构区抗原C C33C 3

3、3C。 。 较第一代试剂较第一代试剂检出率提高检出率提高25-30%,抗体出现提早抗体出现提早 到到16-60天。天。 丙肝病毒抗体 29 不足： 由于重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽, 所以仍存在抗-SOD造成的假阳性问题,于 是激发人们建立人工合成肽段检测抗- HCV的新试剂。 丙肝病毒抗体 30 核心区抗原比例相对下降,而相应也增加了NS3区 C33C的比例,优化了试剂盒的组装工艺； 利用现代基因重组技术,对一些重要抗原采用更 好的表达、纯化系统,利用先进的生产工艺、使 包被抗原的活性更强,增加了检测的灵敏度,减少 了非特异性反应； 加入了NS5区抗原。 丙肝病毒抗体 31 目前我国多采

4、用第三代抗-HCV ELISA试剂,其 敏感性超过99%,虽然目前缺乏判断其敏感性的 金标准,但对于免疫功能正常的HCV RNA阳性感 染者,抗-HCV检出率也高于99%。 丙肝病毒抗体 32 检测原理：以待测血清中的HCV抗体和分别固定 在硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜等载体上 的不同HCV抗原之间的特异性结合反应为基础,测定 待测样品中抗-HCV的存在和有无。 丙肝病毒抗体 33 因为HCV的各种抗原分别被单独固化在载体的不 同位置上,因此,该项检测可以区分待测样品对 HCV不同抗原的不同反应。 目前RIBA HCV已经得到FDA的认可,成为抗-HCV确 认的标准。 临床意义：RIBA

5、阳性的患者中75-80%为病毒血 症(HCV RNA);RIBA阳性而血清中没有HCV RNA时 提示可能为既往感染。 丙肝病毒抗体 34 实时荧光监测实时荧光监测PCR 检测原理：检测原理：在在PCRPCR扩增反应管内加入了标记有两种扩增反应管内加入了标记有两种 染料的针对靶序列的探针染料的针对靶序列的探针, ,每当一次扩增反应中一每当一次扩增反应中一 条探针与靶序列退火结合后条探针与靶序列退火结合后, ,整个反应体系就会增整个反应体系就会增 加一个单位的荧光加一个单位的荧光. .从而得出每一次扩增循环结束从而得出每一次扩增循环结束 后产物的量后产物的量. . 丙肝病毒抗体 35 临床意义：

6、 特异性强：抗-HCV阳性并不能代表现症感染,丙 型肝炎的诊断标准是HCV-RNA. 敏感性高：可发现抗-HCV阴性者HCV感染. 阳性出现早：在“窗口期”没有抗-HCV产生,但 可检测出RNA. 可指导用药：为疗效观察及预后判断提供指标. 丙肝病毒抗体 36 与HBV DNA相比，HCV RNA检测更为复 杂和困难,检出率低: 血清中病毒含量低,且有一定波动,呈间歇阳性; 易被RNA酶降解; HCV RNA受进食的影响,HCV易与血中脂质及脂蛋 白结合,致使其检出率降低; 二次PCR,其中任何步骤的问题均易影响其检出。 丙肝病毒抗体 37 任芙蓉,等. 中华肝脏病杂志, 2005,13:25

7、5-258 丙肝病毒抗体 38 *以S/Co 3.8 (OCD HCV ELISA 3.0) 或 8.0 (OCD VITROS ECi/ECiQ HCV)为“界值”。 丙肝病毒抗体 39 l目前临床应用检测自身抗体的主要免疫学试验技术种 类有：间接免疫荧光法（indirect immune fluorescence, IIF）、直接免疫荧光法(IF)、酶联免疫吸附试验 （ELISA）、免疫印迹技术、乳胶颗粒凝集、免疫扩 散、免疫电泳、放射免疫检验和酶免疫细胞化学等。 其中，IIF法、免疫印迹法和ELISA法被广泛用于临床 检测直接抗细胞成份和可溶性细胞成份抗体的检测。 有时为了弥补试验技术或

8、试剂中可能存在的缺陷以及 试验条件的影响，提高试验结果的特异性和敏感性， 也用一种方法检测多种自身抗体，或一种自身抗体用 多种试验方法检测 。 40 41 实验原理 将膜条上平行包被数种纯化的、 已鉴定生化特性的抗原线作为固相。 象固定生物薄片一样将膜条固定在载 片的反应区。 若是阳性，已稀释血清中的特异 性抗体将与固相上的抗原结合。 第二步，碱性磷酸酶(AP)标记的 抗人抗体与已结合的抗体反应。 第三步，加入可产生颜色反应的 色原底物溶液温育。若标本中含有 待测的特异性抗体，相应的抗原条带 将呈现较深的颜色。 42 结果判断简单，可靠 不需特殊仪器，肉眼判 断结果 由于把抗原包被在固定 的位

9、置判断实验结果比免疫 印迹法简单，更适合常规检 测 反应区的质控带呈显较 深的颜色反应说明操作正确 。 阴阳性结果差别明显。 条带显色的深浅与抗体滴度 相关。 抗原经亲和层析分离纯 化。膜条上没有多余蛋白， 不会产生非特异性反应。 反应过的载片可长期保 存，试验结果容易存档。 43 ENA多肽抗体谱（免疫印迹法） 44 l (1)同一批号NC膜与同一批号标准带相比：了解了 NC膜制备可知只有同一批号才有比较价值，因在一次 电泳中各种ENA抗原泳动位置相同，不同批号时因每 每电泳条件不可能完全一致而没有可比性；电泳中蛋 白质迁移率衡定，各种蛋白质先后顺序衡定，但各蛋 白质之间距离(mm)因每次电

10、泳条件不同而有变化。 l (2)标本膜条“O”线与标准带“O”线对齐：有时病人 血中仅含有一种单抗原区带显色的ENA抗体甚或一种 非特异显色区带，如果没有将“O”线对齐，12mm的 偏差就会误判为另一种ENA抗体或误为非特异显色而 报出错误的报告。 45 l理论上同一分子量的蛋白质在一次电泳中泳动速度是 一致的，从“O”线至电泳位置的距离是一样的；实际 上，一整块聚丙酰胺凝胶电泳时虽蛋白质同起于“O” 线，但两边蛋白质因各种因素的作用而速度有变，使 在整块凝胶上两边蛋白质呈一条弧线，厂家在切制NC 膜条时应将周边误差部分切除，但有时仍有余留。这 余留部分就会造成标准带的误差，检验人员在观察结

11、果时应注意这一问题。 lIBT同ELISA都是通过酶标记显色判断结果，有关试验 注意事项有很多类同：洗涤液要洁净，有霉菌等污染 时非特异显色；清洗要彻底，以防显色底色过深影响 结果判断；IBT的显色液(-氨基联苯胺)与ELISA的显 色液(TMB或OPD)完全不同，不能将显色液混用或替 代。 46 l梅毒的病原是苍白螺旋体(TP)，感染后患者血清学反 应较复杂，可产生2种抗体，一种是梅毒螺旋体非特异 性抗体；另一种是TP特异性抗体。目前常用的抗TP特 异性抗体试验有：梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)、TPPA、 FTA-ABS、ELISA。这些方法敏感性和特异性都较高， 而FTA-ABS是诊断梅毒的血清学金标准，但受到一些 条件的限制不容易普及。ELISA和TPPA是国内使用主 要方法。 l常用的抗TP非特异性抗体试验有甲苯胺红不加热血清 试验(TRUST) 梅毒螺旋体.TP 47 l螺旋体进入人体后可产生很多抗体，这些抗体 可以是针对梅毒螺旋体不同成份的。梅毒的体 液免疫反应有下列表现：（1）特异性抗体： 二期梅毒病人血清中产生