植物病原菌致病机理研究进展级植物保护

1、水稻细菌性褐条病水稻细菌性褐条病 目录目录 概述概述 水稻细菌性褐条病及其致病细菌水稻细菌性褐条病及其致病细菌 细菌细菌IVIV型菌毛型菌毛 细菌的细菌的V VI I型分泌系统型分泌系统 pilpilP P基因在基因在A Aoryzaeoryzae上的功能小结上的功能小结 A Aoryzae RSoryzae RS- -1 1的致病机理研究的致病机理研究 概述概述 水稻细菌性褐条病的病原物早先被报道为丁香假单胞水稻细菌性褐条病的病原物早先被报道为丁香假单胞 菌属致病变种菌属致病变种( (Pseudomonas syringae pvPseudomonas syringae pvpanici(E

2、lliott)panici(Elliott) )， 后来经深入比较研究，确定其病原物为后来经深入比较研究，确定其病原物为PseudomonasavenaePseudomonasavenae。 随着科学家对细菌分类的不断完善随着科学家对细菌分类的不断完善, ,PseudomonasPseudomonas属中非荧光属中非荧光 菌独立成多个属，其中菌独立成多个属，其中avenaeavenae被归入嗜酸菌属被归入嗜酸菌属( (AcidovoraxAcidovorax) ) 并命名为并命名为Acidovorax avenae subspAcidovorax avenae subspavenaeavena

3、e。 值得一提的是，这个亚种中包含了引起麦类细菌性褐值得一提的是，这个亚种中包含了引起麦类细菌性褐 条病和引起水稻细菌性褐条病的病原，后来为了更明确起条病和引起水稻细菌性褐条病的病原，后来为了更明确起 见，又将其中水稻细菌性褐条病的病原确立见，又将其中水稻细菌性褐条病的病原确立Acidovorax Acidovorax oryzaeoryzae。根据最新的细菌分类及命名规定，在本实验中，。根据最新的细菌分类及命名规定，在本实验中， 将水稻细菌性褐条病原统一为将水稻细菌性褐条病原统一为Acidovorax oryzaeAcidovorax oryzae，实验，实验 过程用到的菌株为由本实验室分离

4、并保存的（过程用到的菌株为由本实验室分离并保存的（A Aoryzae oryzae RSRS- -1 1）菌株。菌株。 水稻细菌性褐条病及其致病细菌水稻细菌性褐条病及其致病细菌 水稻细菌性褐条病的水稻细菌性褐条病的发生与危害发生与危害及其病原物及其病原物 水稻细菌性褐条病的水稻细菌性褐条病的防治防治 水稻细菌性褐条病的发生、危害及其病水稻细菌性褐条病的发生、危害及其病 原物原物 我国的水稻细菌性褐条病主要发生在南方地区，在广我国的水稻细菌性褐条病主要发生在南方地区，在广 东、广西、福建、四川、浙江、江苏、江西、湖南、湖北东、广西、福建、四川、浙江、江苏、江西、湖南、湖北 及台湾等地区均有发病记

5、录；近年来，这种病害有蔓延至及台湾等地区均有发病记录；近年来，这种病害有蔓延至 北方稻区的趋势北方稻区的趋势; ;。 发病初期，叶片或叶鞘上出现近圆形褐色小斑点，随发病初期，叶片或叶鞘上出现近圆形褐色小斑点，随 着发病严重，斑点逐渐扩展呈边缘清楚的褐色长条斑，并着发病严重，斑点逐渐扩展呈边缘清楚的褐色长条斑，并 蔓延到整个植株。蔓延到整个植株。 严重时整个颖壳变褐，并深入米粒使之呈褐色，多秕严重时整个颖壳变褐，并深入米粒使之呈褐色，多秕 谷，甚至颗粒无收。谷，甚至颗粒无收。 水稻细菌性褐条病的防治水稻细菌性褐条病的防治 在综合防治方面，需要搞好农田基本建设，加强田间管在综合防治方面，需要搞好农

6、田基本建设，加强田间管 理，建立合理的排灌系统，这样可以有效避免洪水发生时淹理，建立合理的排灌系统，这样可以有效避免洪水发生时淹 灭稻田。另外，灌溉时要防止深灌积水以避免稻株相互感染。灭稻田。另外，灌溉时要防止深灌积水以避免稻株相互感染。 对于已经被淹没的农田，应该及时排水晒田，清洗泥沙，防对于已经被淹没的农田，应该及时排水晒田，清洗泥沙，防 止病害流行。对于初发病或发了病的田块，要立即每亩撒施止病害流行。对于初发病或发了病的田块，要立即每亩撒施 石灰或草木灰石灰或草木灰3030- -4040斤，同时喷洒农用链霉斤，同时喷洒农用链霉500500- -600600倍液。倍液。 细菌细菌IVIV型

7、菌毛型菌毛 细菌菌毛的生理功能和分类细菌菌毛的生理功能和分类 细菌细菌IVIV型菌毛与细菌的型菌毛与细菌的游动性游动性、生物膜形成生物膜形成以及以及致病性致病性的的 关系关系 细菌菌毛的生理功能细菌菌毛的生理功能 菌毛菌毛(Pilus)(Pilus)存在于大多数革兰氏阴性菌及少数革兰存在于大多数革兰氏阴性菌及少数革兰 氏阳性菌的细胞表面。与鞭毛相比，他们通常氏阳性菌的细胞表面。与鞭毛相比，他们通常更细、更短更细、更短 而且直硬而且直硬, ,可将其分为两大类普通菌毛可将其分为两大类普通菌毛(Common Pili)(Common Pili)和性和性 菌毛菌毛(Sex Pili(Sex Pili或

8、或Conjugal Pili)Conjugal Pili)性菌毛比普通菌毛略粗。性菌毛比普通菌毛略粗。 细菌通过细胞的暂时沟通而将遗传物质转移，这个过细菌通过细胞的暂时沟通而将遗传物质转移，这个过 程叫做程叫做“接合接合(Conjugation)(Conjugation)”。 大量的实验证据显示，性菌毛是细菌接合时遗传物质大量的实验证据显示，性菌毛是细菌接合时遗传物质 的通道：性菌毛与与接受细胞的通道：性菌毛与与接受细胞(Recipient Cell)(Recipient Cell)上的受体上的受体 蛋白蛋白(Receptor Protein)(Receptor Protein)结合，去聚结合

9、，去聚(Depolymerisation)(Depolymerisation) 作用产生，作用产生，性菌毛缩短，将两个细胞拉近，性菌毛缩短，将两个细胞拉近，质粒或者染色质粒或者染色 体体DNADNA可通过性菌毛的桥梁作用转移到另一个细胞中。可通过性菌毛的桥梁作用转移到另一个细胞中。 普通菌毛长普通菌毛长0.3-1.0um0.3-1.0um，直径约为，直径约为7 nm7 nm，通常每个菌，通常每个菌 体上分布有体上分布有15015015001500个，散布于细菌的表面，目前已根个，散布于细菌的表面，目前已根 据菌毛的数量，形态，分布情况，附着力，抗原性等特点。据菌毛的数量，形态，分布情况，附着力

10、，抗原性等特点。 细菌菌毛的分类细菌菌毛的分类 将普通茵毛分为将普通茵毛分为IVIIVI这六种类型。这六种类型。 I I型和型和VIVI型菌毛型菌毛可可 以直接凝结人或动物的红细胞，又根据是否能被以直接凝结人或动物的红细胞，又根据是否能被D D甘露甘露 醇抑制而分为甘露醇敏感血凝和甘露醇耐受血凝两类。具醇抑制而分为甘露醇敏感血凝和甘露醇耐受血凝两类。具 有有I I型菌毛型菌毛的细菌多为前者，而具有的细菌多为前者，而具有VIVI型菌毛型菌毛的细菌多为的细菌多为 后者以大肠杆菌为例，后者以大肠杆菌为例，I I型菌毛型菌毛主要由主要由Fim AFim A，Fim FFim F，Fim Fim G G

11、，Fim HFim H等蛋白构成，其中等蛋白构成，其中Fim HFim H蛋白是作为受体蛋白，蛋白是作为受体蛋白， 使细菌细胞与其寄主细胞的使细菌细胞与其寄主细胞的D D甘露糖互作，从而帮助细甘露糖互作，从而帮助细 菌定殖在肠粘膜的表面，继而诱发了肠道疾病菌定殖在肠粘膜的表面，继而诱发了肠道疾病, ,一些沙门一些沙门 氏菌属的细菌具有氏菌属的细菌具有IIII型菌毛型菌毛。但尚未发现其具有血凝作用。但尚未发现其具有血凝作用。 有些克雷伯以及沙雷氏菌属细菌有一种比较纤细的有些克雷伯以及沙雷氏菌属细菌有一种比较纤细的 IIIIII型菌毛型菌毛，可以直接黏附在真菌、植物细胞甚至玻璃的，可以直接黏附在真

12、菌、植物细胞甚至玻璃的 表面，但是不能黏附于动物细胞。因此，表面，但是不能黏附于动物细胞。因此，D-D-甘露醇对此类甘露醇对此类 血凝没有抑制作用血凝没有抑制作用(MRHA)(MRHA)。IVIV型菌毛型菌毛大多能引起甘露醇抵大多能引起甘露醇抵 抗性血凝，即抗性血凝，即MRHAMRHA。不同于其他几种类型的周生菌毛，。不同于其他几种类型的周生菌毛，V V 型菌毛为丛生菌毛。型菌毛为丛生菌毛。 IVIV型菌毛组成结构型菌毛组成结构 细菌细菌IVIV型菌毛与细菌的型菌毛与细菌的游动性的关游动性的关 系系 早在上世纪早在上世纪7070年年HenrichsenHenrichsen等研究表明细菌在固体表

13、等研究表明细菌在固体表 面运动的能力，即细菌的面运动的能力，即细菌的“游动性游动性(Twitching (Twitching Motility)”Motility)”，是由，是由IVIV型菌毛的收缩产生的，它是细菌表型菌毛的收缩产生的，它是细菌表 面的一种移动方式，细菌通过这种方式产生菌落边缘的菌面的一种移动方式，细菌通过这种方式产生菌落边缘的菌 圈圈 。细菌的吸附和在寄主细胞上的定殖能力是其侵染寄。细菌的吸附和在寄主细胞上的定殖能力是其侵染寄 主、使寄主致病的第一步。主、使寄主致病的第一步。 当细菌细胞单个存在时，并没有游动能力。当细菌细胞单个存在时，并没有游动能力。 细菌细菌IVIV型菌毛

14、与生物膜和致病性形型菌毛与生物膜和致病性形 成的关系成的关系 生物膜是细菌在物体表面形成的高度组织化的多细胞生物膜是细菌在物体表面形成的高度组织化的多细胞 结构，是细菌为了适应环境而采取的一种生存方式，可以结构，是细菌为了适应环境而采取的一种生存方式，可以 帮助细菌逃避机体免疫和抗菌药物的杀伤作用。帮助细菌逃避机体免疫和抗菌药物的杀伤作用。 细菌的细菌的V VI I型分泌系统型分泌系统 细菌的分泌系统和细菌的分泌系统和VIVI型分泌系统的发现；型分泌系统的发现； T T6SS6SS的结构组成；的结构组成； 细菌的分泌系统和细菌的分泌系统和VIVI型分泌系统的型分泌系统的 发现发现 细菌的分泌系

15、统细菌的分泌系统(Secretion System)(Secretion System)是一个类似于注是一个类似于注 射器一样的结构，它与细菌的致病性密切相关。致病性细射器一样的结构，它与细菌的致病性密切相关。致病性细 菌通过分泌系统将胞外蛋白或效应蛋白运送入外界环境，菌通过分泌系统将胞外蛋白或效应蛋白运送入外界环境， 或者直接作用于寄主细胞的靶位点，使宿主致病。或者直接作用于寄主细胞的靶位点，使宿主致病。 细菌细菌VIVI型分泌系统型分泌系统(Type VI SecretionSystem(Type VI SecretionSystem，T6SST6SS) ) 是最近才被发现和研究的一种分泌

16、系统，广泛存在于革兰是最近才被发现和研究的一种分泌系统，广泛存在于革兰 氏阴性致病菌中。氏阴性致病菌中。 T T6SS6SS的结构组成的结构组成 T6SST6SS是由一系列蛋白组成的复合体，按照蛋白功能的是由一系列蛋白组成的复合体，按照蛋白功能的 不同可分为结构蛋白，效应蛋白，调节蛋白和分子伴侣蛋不同可分为结构蛋白，效应蛋白，调节蛋白和分子伴侣蛋 白白. .。典型的。典型的T6SST6SS由由15-2515-25个保守的开放阅读框组成，并由个保守的开放阅读框组成，并由 这些基因编码的蛋白组成跨膜结构，由这些基因编码的蛋白组成跨膜结构，由Icm FIcm F和和Dot UDot U等蛋等蛋 白构

17、成的结构横跨细菌细胞内膜白构成的结构横跨细菌细胞内膜- -周质周质- -外膜，并将效应蛋外膜，并将效应蛋 白分泌和转运出去，直接到达宿主细胞内。白分泌和转运出去，直接到达宿主细胞内。 虽然这些基因的转录方向不完全相同，但是都有虽然这些基因的转录方向不完全相同，但是都有1313个个 保守的核心元件组分和保守的核心元件组分和T6SST6SS基因簇编码的辅助原件构成。基因簇编码的辅助原件构成。 T6SST6SS结构组成结构组成 A Aoryzaeoryzae突变体的构建和回补突变体的构建和回补 单交换同源重组构建单交换同源重组构建pilpilP P、icmicmF F、dotUdotU基因基因的插入

18、突的插入突 变变: :经过经过PCRPCR、测序鉴定后，最终得到突变体菌株。、测序鉴定后，最终得到突变体菌株。 通过这种方法，得到了通过这种方法，得到了pilpilP P、icmFicmF、dotUdotU基因基因的突变的突变 体，并分别命名为体，并分别命名为RS-PRS-P、RS-FRS-F、RS-DRS-D。 pilpilP P基因在基因在A Aoryzaeoryzae上的功能小结上的功能小结 敲除敲除pilppilp基因后，基因后，A Aoryzaeoryzae致病性显著下降；致病性显著下降； pilppilp基因缺失后，细菌丧失菌圈和基因缺失后，细菌丧失菌圈和IvIv型菌毛；型菌毛；

19、pilppilp基因能够影响基因能够影响A Aoryzaeoryzae的游动性及生物膜形成。的游动性及生物膜形成。 水稻细菌性褐条病菌水稻细菌性褐条病菌A Aoryzaeoryzae中中icmFicmF和和 dotUdotU基因的相互作用基因的相互作用 T6SS T6SS能够影响能够影响A Aoryzseoryzse细菌致病性细菌致病性: :表明表明icm Ficm F和和dot dot U U基因可以影响基因可以影响A Aoryzaeoryzae的致病性，当基因缺失时，细菌的致病性，当基因缺失时，细菌 表现为弱致病性表现为弱致病性. . A Aoryzae RSoryzae RS- -1 1

20、的的致病机理研究致病机理研究 pilP pilP基因能够通过影响细菌基因能够通过影响细菌IVIV型菌毛形成，继而影响型菌毛形成，继而影响 细菌的游动能力、生物膜形成和致病性。细菌的游动能力、生物膜形成和致病性。A Aoryzaeoryzae作为作为 一种致病细菌，其最重要的功能之一就是侵染寄主使之生一种致病细菌，其最重要的功能之一就是侵染寄主使之生 病。病。 通过通过IVIV型菌毛使细菌在寄主细胞表面定殖是它侵染寄型菌毛使细菌在寄主细胞表面定殖是它侵染寄 主的第一步，而主的第一步，而pilPpilP基因则是基因则是IVIV型菌毛合成和装配过程中型菌毛合成和装配过程中 起到重要作用的起到重要作用

21、的pilpilP P MNOPQ MNOPQ操纵子中的一员。操纵子中的一员。 在本研究中，通过单交换同源重组，利用自杀质粒在本研究中，通过单交换同源重组，利用自杀质粒p p JP5603JP5603，构造了，构造了pil Ppil P基因突变体。将该突变体菌株接种水基因突变体。将该突变体菌株接种水 稻后，细菌的稻后，细菌的致病力明显降低致病力明显降低。通过光学显微镜和透射显微。通过光学显微镜和透射显微 镜发现，当该基因的功能缺失时，镜发现，当该基因的功能缺失时，A Aoryzaeoryzae无法形成正常无法形成正常 的典型的菌圈，也的典型的菌圈，也无法形成完整无法形成完整的周生菌毛；的周生菌毛

22、； 软琼脂培养基实验表明细菌的软琼脂培养基实验表明细菌的游动能力大幅下降游动能力大幅下降； 细菌生物膜测定结果表明细菌生物膜测定结果表明pil Ppil P基因突变体的基因突变体的生物膜形生物膜形 成数量成数量显著降低。显著降低。 此项研究为我们防治水稻细菌性褐条病提供此项研究为我们防治水稻细菌性褐条病提供 了一种很好的思路：将细菌菌毛作为药剂的靶标了一种很好的思路：将细菌菌毛作为药剂的靶标 位点，对该病害的防治或将起到良好的效果。位点，对该病害的防治或将起到良好的效果。 Aoryzae RS-1的的致病机理研究致病机理研究 T6SS T6SS的核心基因的核心基因icm Ficm F和和dot

23、 Udot U可以影响细酋可以影响细酋 TS66TS66的功能以及致病性，这两个基因之间存在互的功能以及致病性，这两个基因之间存在互 作关系。细菌的作关系。细菌的VIVI型分泌系统是近些年才被发现型分泌系统是近些年才被发现 的一种新型分泌系统，在的一种新型分泌系统，在A Aoryzaeoryzae中也存在着中也存在着 T6SST6SS结构。结构。 在其中的保守元件中，在其中的保守元件中，Icm FIcm F和和Dot UDot U是两个是两个 关键的核心蛋白。通过单交换同源重组，利用自关键的核心蛋白。通过单交换同源重组，利用自 杀质粒杀质粒p JP5603p JP5603，构造了，构造了icm

24、 Ficm F和和dot Udot U基因突变基因突变 体。将这两个突变体菌株接种水稻后发现，其致体。将这两个突变体菌株接种水稻后发现，其致 病力均有所降低。病力均有所降低。 利用细菌双杂交和双分子荧光互补分析，表利用细菌双杂交和双分子荧光互补分析，表 明了明了icm Ficm F和和dot Udot U基因之间存在相互作用关系。基因之间存在相互作用关系。 这为此后更加系统的研究这为此后更加系统的研究T6SST6SS的结构和功能提供的结构和功能提供 了基础。了基础。 芸薹根肿菌致病机理芸薹根肿菌致病机理 研究进展（研究进展（附附） 芸薹根肿菌芸薹根肿菌 芸薹根肿菌芸薹根肿菌 (Plasraod

25、iophora (Plasraodiophora brassicae Woron)brassicae Woron)是是 一一 种土传性活体寄种土传性活体寄 生菌，专性寄生于十字花科植物，导致根生菌，专性寄生于十字花科植物，导致根 肿病的发生。肿病的发生。 受害寄主植株感病初期地上部无明显差异或特殊的表受害寄主植株感病初期地上部无明显差异或特殊的表 现，而在感病后期，地上部叶片由下而上逐渐发黄，出现现，而在感病后期，地上部叶片由下而上逐渐发黄，出现 持续性失水萎蔫。持续性失水萎蔫。 相较于正常植株相较于正常植株，感病株生长缓慢，株型矮小，地下，感病株生长缓慢，株型矮小，地下 部主根、侧根和须根上

26、形成数目和大小不等、呈指状部主根、侧根和须根上形成数目和大小不等、呈指状 、 短棒状或球形的短棒状或球形的 肿瘤肿瘤 ，根肿发生初期表面光滑，根肿发生初期表面光滑 ，后期，后期 则会则会 出现龟裂出现龟裂 、粗、粗 糙糙 、变黄、变黄 ，最后整个受害根部组，最后整个受害根部组 织织 出现腐烂出现腐烂 ，滋生各种，滋生各种 真菌，形成白色的菌丝层或滋真菌，形成白色的菌丝层或滋 生多种害虫，地上部植株枯萎死亡。生多种害虫，地上部植株枯萎死亡。 激素与芸薹根肿菌致病的关系激素与芸薹根肿菌致病的关系 G-rsic G-rsic等等“研究表明，吲哚乙酸合成中起关研究表明，吲哚乙酸合成中起关 键作用的腈水

27、解酶活性及其键作用的腈水解酶活性及其mRNAmRNA转录水平明显增转录水平明显增 强，之后他们对腈水解酶基因的拟南芥突变株系强，之后他们对腈水解酶基因的拟南芥突变株系 研究发现，突变株相较于对照更加耐受芸薹根肿研究发现，突变株相较于对照更加耐受芸薹根肿 菌的侵染。菌的侵染。 有活性的吲哚乙酸的另一个来源是结合态的有活性的吲哚乙酸的另一个来源是结合态的 吲哚吲哚 乙酸在水解酶的作用下水解成自由态的吲哚乙酸在水解酶的作用下水解成自由态的吲哚 乙酸。乙酸。 G-rsicG-rsic等等研究发现芸薹根肿菌侵染寄主时研究发现芸薹根肿菌侵染寄主时 ， 该水解酶活性显著增强，甚至认为芸薹根肿菌能该水解酶活性

28、显著增强，甚至认为芸薹根肿菌能 合成产生结合态吲哚乙酸水解酶。合成产生结合态吲哚乙酸水解酶。 除生长素合成增量增加外，生长素运输相关除生长素合成增量增加外，生长素运输相关 基因在根肿菌侵染时期也上调表达。基因在根肿菌侵染时期也上调表达。 SylvieSylvie等将生长素运输蛋白等将生长素运输蛋白a al lm m1 1基因基因敲除后敲除后 ， 突变株表现为增强对根肿菌的耐受性，在根肿菌突变株表现为增强对根肿菌的耐受性，在根肿菌 侵染侵染3232天后天后 ，其根肿大小仅为对照植株的三分之，其根肿大小仅为对照植株的三分之 一。一。 以上研究表明，生长素在芸薹根肿菌的致病以上研究表明，生长素在芸薹

29、根肿菌的致病 过程中起着不可替代的重要作用，过程中起着不可替代的重要作用，然而十字花科然而十字花科 植物生长素的生物合成途径有很多，它们之间相植物生长素的生物合成途径有很多，它们之间相 互联系，并在植物生长发育的不同阶段和不同的互联系，并在植物生长发育的不同阶段和不同的 胁迫环境中起作用胁迫环境中起作用。 有研究结果显示有研究结果显示 ，根肿组织里的自由态和结，根肿组织里的自由态和结 合态细胞分裂素浓度是正常根组织中的合态细胞分裂素浓度是正常根组织中的2 23 3倍；倍； Dekhuijzent Dekhuijzent 发现寄主细胞质与根肿菌的原发现寄主细胞质与根肿菌的原 质团存在细胞分裂素质

30、团存在细胞分裂素(CTK)(CTK)差异，在病原菌原质团差异，在病原菌原质团 中主要以玉米素核糖苷及其葡萄糖的衍生物形式中主要以玉米素核糖苷及其葡萄糖的衍生物形式 存在存在 ，而寄主细胞质中则为玉米素核糖苷、少量，而寄主细胞质中则为玉米素核糖苷、少量 的玉米素以及玉米素葡萄糖磷酸盐衍生物；的玉米素以及玉米素葡萄糖磷酸盐衍生物； MiillerMiiller和和 Hilgenberg Hilgenberg发现，在接种休眠孢发现，在接种休眠孢 子子2323天后，寄主植株中分离得到的次级原质团可天后，寄主植株中分离得到的次级原质团可 以将以将 C C 标记的腺嘌呤同化为反玉米素。标记的腺嘌呤同化为反玉米素。 以上研究结果可以得出结论，在侵染后期，以上研究结果可以得出结论，在侵染后期， 芸薹根肿菌自身能合成细胞分裂素并释放到寄主芸薹根肿菌自身能合成细胞分裂素并释放到寄主 细胞质中。细胞质中。 转录组学研究证明，细胞分裂素氧化酶脱转录组学研究证明，细