用DAPI和Hoechst33342染色法检测DNA的流式细胞方法探讨

1、用DAPI和Hoechst33342染色法检测DNA的流式细胞方法探讨?480?北京大学(医学版)JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES)Vo1.42No.4Aug.2010?技术=5-法?用DAPI和Hoechst33342染色法检测DNA的流式细胞方法探讨刘锡娟,丁慧荣,张宏(北京大学临床肿瘤学院,北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所中心实验室,恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室,北京100142)摘要目的:探索利用DAPI和Hoechst33342两种荧光染料检测DNA的流式细胞技术.方法:分别用DAPI,Hochest和PI3种荧光染料标

2、记HT-29细胞,通过流式细胞仪检测其G0/G1期,s期和G2/M期的DNA含量,比较3种方法测定结果.用标准荧光微球和DNA质量控制试剂盒做测试质控.结果:质控实验显示,紫外激光的变异系数(cv)为2.4;DAPI和Hoechst33342标记的小鸡红细胞核(chickenerythroeytenuclei,CEN)出现4个峰,第2,第3和第4峰所在道数的平均值与第1峰的比值为2,3,4,且第1峰的CV均为2.4.DAPI,Hoechst33342标记小牛胸腺细胞核(calfthymocytenuclei,CTN)出现2个峰,G2/G1为1.97,且G0/G1峰的CV为2.4.DAPI,H0

3、echst33342和PI3种染料标记的HT-29细胞呈现完整的细胞周期峰,结果分别为CV值3.40,3.02和4.42,G0/G1期含量为60.86%,60.22%和6o.81%,s期含量为28.85%,29.70%和29.82%,G2/M期含量为10.29%,9.09%和9.37%,3种标记法测定结果一致.结论:本文探索的DAP1和Hoechst33342标记法简单易行,可作为具备紫外激光器的流式细胞仪的首选DNA荧光染料.关键词染色与标记;流式细胞术;DNA;细胞周期中图分类号】R446-39文献标识码A文章编号1671167X(2010)04-0480-05doi:10.3969/j.

4、issn.1671-167X.2010.04.028AmethodologystudyonflowcytometricanalysisofcellDNAstained,)l,ithDAPIandHoechst33342LIUXi-juan,DINGHuirong,ZHANGHongKeyLaboratoryofCarcinogenesisandTranslationalResearch(MinistryofEducation),Centralab,PekingUniversitySchoolofOncology,BeijingCancerHospital&Institute,Beiji

5、ng100142,ChinaABSTRACT0bjective:TodiscussasimplemethodforflowcytometrieanalysisofcellDNAstainedwithDAPIandHoechst33342.Methods:HT29cellsstainedwithDAPI,Hoechst33342orP1weremeasuredbvBDFACSAriaandthepercentagesofcellsinGO/G1.SandG2/Mphaseswiththreestainingme-thods.thentheresultswereanalyzedandcompare

6、d.BeforemeasurementwemonitoredthequalityofDNAanalysisofflowcytometerthroughUVbeadsQcexperimentandanalyzedthestandardchickenerythroeytenuclei(CEN)andcalfthymocytenuclei(CTN)stainedwithDAPIandHoeehst33342.Re-suits:CVvalueofUVpeakwas2.4afterQCexperiments.Therewere4peaksonCENhistogramsandtheratiosofpeak

7、channelmeanofG2/Gl,G3/G1,andG4/G1wereabout2,3,and4respectively.BothCVvaluesofthefirstpeakwere2.4.Therewere2peaksonCTNhistogramsandtheratioofpeakchannelmeanofG2/G1was1.97.andCVvalueofGO/G12.4.ThecompletecellcycleofHT29cellsstainedwithDAPI.Hoechst33342orP1wasshowedentirely,Cvalueswere3.40,3.02and4.42,

8、respeetively.andthepercentagesofcellsinGO/G1were60.86%.60.22%and60.8l%,respectively,i13S.28.85%,29.7O%and29.82%,respectively.andinG2/M.10.29%,9.09%and9.37%,respectively.Theresultsbythethreemethodsshowednodifference.Conclusion:ThismethodformeasurementofcellularDNAcontentisasimpleande伍cientapproachtod

9、eterminingcellcycleandcanbethefirstchoicewhenusingflowcytometerwith355nmUV.KEYW0RDSStainingandlabeling;Flowcytometry;DNA;Cellcycle细胞周期和细胞倍体的分析已经成为肿瘤研究中13益重要的研究手段,广泛应用于肿瘤基础和临床研究,为肿瘤的诊断,治疗和预后判断等提供了重要的参考指标.利用核酸染料标记DNA,流式细基金项目:激光显微切割仪与其他院内科研平台的联合应用(09-07)ThejointapplicationofLCMandSELDI-TOFMS,2-dimensio

10、nalelectrophoresistechnologyplatforms(09-07)AConespondingauorse-mail,liuxj-2003163.coinTheseauthorscontributedequallytothiswork刘锡娟,等用DAPI和Hoechst33342染色法检测DNA的流式细胞方法探讨胞仪可以快速测定细胞核中的DNA含量,精确定量细胞周期中G0/G1%,S%及G2/M%,各个时相的分布状态,从而了解细胞的增殖能力_2J.碘化丙啶(propidiumiodide,PI)是流式细胞仪检测细胞DNA含量的常用染料J,它可选择性嵌入到核酸的双螺旋碱基对中

11、,发射光为红色,由488nm激发光激发,发射光谱为610620nm,使用时需用RNase对细胞进行处理,以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响.DAPI和Hoechst33342也是两种标记细胞DNA的染料,可以非嵌入方式与DNA链上的A.T碱基对特异性结合,发射光为蓝色,由355nm激发光激发,发射光谱为400500nm.DAPI与双链DNA结合时,荧光强度增强20倍,而与单链DNA结合则无荧光增强,与RNA结合不会形成强荧光,明显弱于DNA,使用时无需用RNase对细胞进行处理.可见,DAPI和Hoechst33342也是理想的DNA定量染料,但由于配置紫外激光源的流式细胞仪非常昂贵,大多

12、数实验室或研究机构的流式细胞仪都没有紫外激光源,所以,以DAPI和Hoechst33342标记DNA分析细胞周期的方法尚未成为常规检测方法被普遍采纳,也没有简单标准的实验流程可供参考.早在70年代,DAPI就被用于DNA染色检测周期,但需采用缓冲液分离得到细胞核后再进行DNA含量的检测_4,液体的配置比较繁琐,处理后的样本只能单一的检测细胞周期中DNA含量的变化,不能同时结合其他参数(如蛋白的表达量等)进行分析.9O年代,染色方法的主要特点是在染色液或固定液中加通透剂卜m,但通透剂可能会影响细胞表面抗原和抗体的结合,从而影响多参数分析的客观性.北京市肿瘤防治研究所中心实验室的BDFACSAri

13、a流式细胞仪配备有355nm紫外激光.本实验拟采用DAPI和Hoechst33342标记HT29细胞,以探索简便易行的DNA检测技术,即采用流式细胞仪的紫外激光器激发DAPI和Hoechst33342染料,检测细胞周期中各期的DNA含量,并与PI染色法进行比较,同时对相应的染色方法,实验流程和参数进行了简化和优化.1材料与方法1.1仪器及试剂所用仪器及试剂如下:BDFACSAria流式细胞仪,质量控制(qualitycontrol,QC)微球包括uVbeads和DNAQCParticles(美国BectonDickinson公司),OLYMPUS倒置显微镜,HT29细胞株,0.25%(体积分数

14、)胰酶(Gibico公司),1640培养基(Gibico公司)和FBS血清(Gibico公司).DAPI和Hoeehst33342的配置方法如下:去离子水溶解,浓度1g/L,配好后用锡纸包起来,避光,可在4下长期保存;使用时用1PBS稀释到最适浓度.1.2样品的制备生长状态良好的HT29细胞经胰酶消化,PBS洗2次,1000r/min离心5min,500IxLPBS重悬,75%(体积分数)乙醇固定,4过夜,1000r/min离心,弃乙醇,将HT29细胞均分为3份,每份10个细J/mL,一份细胞悬浮于1mLDAPI染液中,终浓度为5mg/L,室温避光染色30min以上,400目筛网过滤后上机检测

15、;一份细胞悬浮于1mLHoeehst33342染液中,终浓度为5mg/L,室温避光染色30min,400目筛网过滤后上机检测;一份细胞经过RNase处理后,悬浮于1mLPI染液中,终浓度为50mg/L,室温避光染色30min,400目筛网过滤后上机检测.1.3DNA分析质量控制DNA分析质量控制是做DNA分析中评价仪器性能和条件的必要测定程序,主要为荧光微球的Qc实验和DNAQC实验,后者包括小鸡红细胞核(chickenerythroeytenuclei,CEN)检测实验和小牛胸腺细胞核(calfthymocytenuclei,CTN)的检测实验CI.1.3.1荧光变异系数(cv)的调整使用美

16、国BectonDickinson公司QC荧光微球调整并确认激光延迟和面积因子,记录相应的电压及细胞荧光CV值.1.3.2仪器线性度和分辨率的检测使用核酸染料DAPI和Hoechst33342标记CEN.将CEN试剂轻轻摇匀后,吸取40L加入至1mLDAPI或Hoechst33342中,混匀,室温避光放置i0min,上机检测.在GlobalWorksheet中画出FSC/SSC散点图,UV2.A/UVW散点图和UV2一A直方图.通过调节电压在FSC/SSC散点图中显示CEN主群,通过设门(R1)圈住主群细胞核左下侧单核群,在UV2一A直方图中显示R1门中细胞核群,将二倍体荧光峰G0/G1峰调至荧

17、光道数为25道处,使用荧光染料发射光谱相对应的接收通道获取细胞20000个.1.3.3双粘体辨别模式(doubletdiscriminationmodule,DDM)有效性的检测使用核酸染料DAPI和Hoechst33342标记CTN,将CTN试剂轻轻摇匀后,吸取40L加入至1mLDAPI或Hoechst33342中,混匀,室温避光放置10min,上机检测.在GlobalWorksheet中画出FSC/SSC散点图,UV2一A/UVW?482?北京大学(医学版)JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES)散点图和UV2.A直方图.通过调节电压在FSC/SS

18、C散点图中找到CTN主群,分别在UV2一A/UVW散点图和UV2一A直方图中显示P1门中细胞群,将二倍体荧光峰G0/G1峰调至荧光道数为50道处,使用荧光染料发射光谱相对应的接收通道获取细胞20000个.1.4检测待测样本将第1.2小节中准备好的经DAPI或Hoechst33342染色后的HT29细胞样品上机进行检测.在GlobalWorksheet中画出FSC/SSC散点图,UV2一A/UV.w散点图和UV2一A直方图.通过调节电压在FSC/SSC散点图中找到主群细胞,通过设门(R1)去除聚集细胞,在UV2一A直方图中显示R1门中细胞群,将二倍体荧光峰G0/G1峰调至荧光道数为50道处,使用

19、荧光染料发射光谱相对应的接收通道获取细胞20000个.1.5导出数据并拟合将Diva软件下获取的数据以FSC2.0的格式输出,打开ModFitLT软件输入数据并拟合,对结果进行比较.ModFitLT是由美国VeritySoftwareHouse公司设计,专门用于流式细胞术中进行细胞周期分析的软件,其通过对DNA含量直方图进行曲线拟合,能快速计算出各种倍体细胞的含量,细胞周期各时相及亚二倍体细胞所占的比例,DNA指数,G0/G1期峰的CV值等.2结果2.1质量控制结果使用Qc紫外荧光微球检测仪器运行的情况,并通过电压,时间延迟和面积因子值的调节,使本次运行过程更稳定,Qc实验后得到CV值较小的紫

20、外激光峰(CV=2.4,图1).2.2DNA标准品检测结果CEN试剂是经过特殊处理而成的,包括单个细胞核,双联体,三联体和更大的聚集体,DAPI和Hoechst33342染色后的检测结果见图2;CTN具有完整的细胞周期,大部分核处于G0/G1期,小部分处于S期和G2/M期,DAPI和Hoechst33342染色后的检测结果见图3.2.3HT29细胞周期分析结果HT29细胞经DAPI,Hoeehst33342和PI染色后上机检测,用ModFitLT软件拟合得到完整的细胞周期图,分为G0/G1期,s期和G2/M期细胞,其中G0/G1的CV分别为3.40,3.02和4.42(图4);GO/G1期含量

21、分别为60.86%,60.22%和6O.81%,s期含量分别为28.85%,29.70%,29.82%,G2/M期含量分别为10.29%,9.09%和9.37%.3种方法所得结果没有明显差异,DNA测定结果基本一致.3讨论目前,流式细胞仪已实现多激光多参数的分析,最高配置可达7根激光近3O个参数,可同时获得细胞的多种信息,从多个角度对细胞的异质性进行深入研究.在做周期分析时,除了根据DNA含量将细胞分为GO/G1期,s期和G2/M期外,也可结合其他因素(比如周期蛋白)进一步将GO和G1期细胞,G2和M期细胞,早G1期和晚G1期细胞分开;也可在发现凋亡峰的同时结合其他检测指标进一步区分凋亡与坏死

22、的细胞,或进一步验证凋亡细胞,因此,能对同一样本做多色分析就很重要.由于PI与PE发射光谱几乎完全重叠,与FITC等也有部分重叠,因此限制了多参数分析;但DAPI,Hoeehst33342与绿色荧光蛋白或TexasRed染色剂的发散波长,仅有少部分重叠,与PE等荧光无光谱重叠,这一优势恰好拓宽了多色分析应用的范围,实现了在进行细胞周期分析的同时结合其他染色以获得更多的信息.在液体配置和实验步骤方面,DAPI和Hoechst染色法的方法和流程上较Pl染色法更为简单,不需要用RNase处理,而且对仪器的污染较小,更容易清洗,尤其适用于分选的仪器.另外,据文献报道,DAPI和PI染色法在做周期分析时

23、,并没有显着差异.,本实验也验证了上述观点.此外,由于DAPI和Hoechst33342都是实验室常备染料,前者常用于免疫荧光染核,后者常用于肿瘤干细胞研究,因此获取均较方便,即使只单纯做一个细胞周期检测,DAPI和Hoeehst染色法也是简单易行的.实验过程中发现,细胞的生长状态,尤其是细胞密度对3种方法的影响都较大.当细胞融合度为50%70%时,细胞生长状态最佳,是做周期检测的最佳细胞密度.其他文献报道的方法中,细胞的染色前准备,细胞的同定时间及乙醇的浓度,DAPI和Hoechst的染色浓度及染色时间差异较大J,而本研究对细胞染色浓度及染色时间做了比较和调整,获得较一致的细胞准备流程和染色

24、程序.另外,DAPI具有很高的光漂白承受水平,实验过程中发现染色后放置24h的样品,检测结果与刚染色后结果相似,稳定性较好.同时,由于DAPI可运用于各种微生物的检测,生长监测,胚胎发育过程的检测,各种核定位的实验,所以,同一样本在做细胞周期分析实验的同时还可以进行相关的其他检测.刘锡娟,等用DAPI和He,echst33342染色法检测DNA的流式细胞方法探讨-483?:=0(V=2.4A2400童00主j2006000=0U(Xl0)50004000善300020001000O(V=2.4I.【15Ol00150200250(10)(2?4【(10)图1利用uv荧光微球调节紫外激光接收的Q

25、c实验峰罔及CV值图2CEN经DAPI(2A)和Hoeehst33342(2B)标记DNA后,流式检测,所得DNA倍体图及第1峰的CV值图3CTN经DAPI(3A)和H0eehs3342(3B)标记DNA后,流式检测,所得DNA倍体图及GO/GI峰c值Figure1HistogramandCVvalueofUV2peakafterQCFigure2Hist0gramsandCVvalueaftermeasurementDNAofCENrepectivelystainedwithDAPI(2A)orHoeehst33342(2B)Figure3HistogramsandCVvalueafterm

26、easulementDNAofCTNrepeetivelystainedwithDAP1(3A)orHoeehst33342(3B)Debris:0.29%Aggrcgates:lI8%-DipGl:6086听_DipG2:1029%_DipS:2885%G2/Gl:183(1f-3404080l20Channels(UV2-A)Channcls(UV2一A1C2000l500】0005000Debris:O31%Aggregates:148%-DipGl:608l%-DipG2:937%一DipS:2982%G2/Gl=196(1.一4.42O4080l20Channels(PI-A)图4H

27、T29细胞经DAPI(A)和Hoeehs3342(B)和PI(c)标记DNA后,流式检测,并经ModFitLT软件模拟结果Figure4Fittinghist.gramsandCVvalueaftermeasurementDNA.fHT29ce11srepeetivelystainedwithDAPI(A),Hoeehsd3342(B)orPI(C)做DNA定量分析时,参数设置为线性,DNA差异范围在线性范围,加之贴壁细胞株的细胞成分不是很单一,其单参数分析结果的准确性受到诸多因素影响,所以,细胞周期分析实验对各参数及仪器状态的变化更加敏感,对仪器的稳定性(包括激光的性能)要求较高,实验成功的

28、关键是获得较小的G0/G1峰的CV值以及较好的荧光强度与DNA量之间的线性关系.因而,在做细胞周期分析实验之前要先做Qc,监控仪器的稳定性并对仪器运行系统进行校准优化.在用UVbeads做质控时,只有CV值小于或等于2.5时,表明仪器的测定误差较低,稳定性较好,即流式细胞仪液流,光路和机器调试等对后续进行生物样品的检测实验的影响可忽略不计.G0/G1峰的CV值不但受到仪器性能及运行的影响,而且受到样品固有性质,如物理和化学性质,样品处理方法及染色方法等的影响.因此,用流式细胞仪进行人类组织细胞DNA定量分析时,最好选用一些接近人类细胞DNA含量的生物细胞作为标准细胞,监控细胞处理,染色流程,并

29、进一步监控仪器的线性度,分辨率及DDM模式的有效性.CEN和CTN均质性较好,大小,形态较一致,实验结果显示,CEN经DAPI或Hoechst33342染色后,各峰的荧光强度形成了很好的倍体关系;CTN经过相同的染色及检测后,各峰形成了完整的细胞周期图,大部分核处于G0/GI期,小部分处于S期和G2/M期.无论是CTN的倍体峰还是CEN的周期峰,第1置jZ北京大学(医学版)JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES)Vo1.42No.4Aug.2010峰的CV值均较小,说明样品的处理没有造成检测的误差,仪器的线性度,分辨率较好,DDM模式具有很好的有效性.

30、本实验以DAPI,Hoechst和P标记HT一29细胞,结果表明,3种标记法检测细胞周期各期的DNA含量相近,差异很小,说明DAPI和Hoechst33342与PI一样,也是一种可靠的DNA检测方法,并且其样本制备更简单,易行.这两种染料可做为带紫外激光器的分选仪上检测DNA的最佳选择.虽然PI的DNA染色效果好,适用于普通流式细胞仪上检测(488nm激发),但由于其具有毒性,污染后不易清除,且不能标记活体细胞等局限性,因此,不适用于在分选仪上检测.每种染料的检测方法各有优缺点,具体使用时要视情况而定.本研究所建立的DAPI和Hoechst33342染色法简单易行,用水溶解后加PBS稀释,不必

31、加通透剂,也不分离核,是一种适用于多参数分析的检测细胞DNA含量的方法,而且实验流程更简单,快速,可做为具备紫外激光器的流式细胞仪上首选的DNA荧光染料.参考文献1吴后男.流式细胞术原理与应用程序M.北京:北京大学医学出版社,2008:471.2王建中.1临床流式细胞分析M.上海:上海科学技术出版社,2005:58.3NunezR.DNAmeasurementandcellcycleanalysisbyflowcy.tometryJ.CurrIssuesMelBiol,2001,3(3):6770.4ChenXY,YangHX,QuSF,eta1.Involvementofp38andc?Ju

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