微生物实验(6)

1、肠道杆菌的鉴定肠道杆菌的鉴定 河南大学医学院河南大学医学院 娄强娄强 qiang_ 目的要求目的要求 掌握肠道杆菌的主要生物学性状掌握肠道杆菌的主要生物学性状 熟悉肠道杆菌有关的鉴定方法熟悉肠道杆菌有关的鉴定方法 标本标本 脓血便、肛拭子脓血便、肛拭子 选择选择/ /鉴别培基鉴别培基 生化反应生化反应 血清学鉴定血清学鉴定 玻片凝玻片凝 集试验集试验 SSSS平板平板, ,中国兰中国兰, ,EMBEMB平板平板 （一）肠道杆菌的形态、染色（一）肠道杆菌的形态、染色 及在选择培养基上的生长情况及在选择培养基上的生长情况 材料材料 菌种：大肠杆菌、痢疾杆菌培养物菌种：大肠杆菌、痢疾杆菌培养物 培养

2、基：培养基：SS平板、平板、EMB 标本片：大肠杆菌、痢疾杆菌标本片：大肠杆菌、痢疾杆菌 SS琼脂平板琼脂平板 （1）营养物质：牛肉膏、蛋白胨）营养物质：牛肉膏、蛋白胨 （2）抑制剂：胆盐、枸椽酸盐、煌绿等，抑）抑制剂：胆盐、枸椽酸盐、煌绿等，抑 制非致病菌的生长；但胆盐能同时促进病制非致病菌的生长；但胆盐能同时促进病 原菌的生长。原菌的生长。 （3）鉴别用糖：乳糖）鉴别用糖：乳糖 （4）指示剂：中性红）指示剂：中性红 SS琼脂培养基选择培养原理琼脂培养基选择培养原理 此培养基是强选择性培养基，此培养基是强选择性培养基，柠檬酸钠和煌绿柠檬酸钠和煌绿对大肠杆菌对大肠杆菌 的生长，对菌体蛋白质的合

3、成起强的抑制作用，而对肠道的生长，对菌体蛋白质的合成起强的抑制作用，而对肠道 致病菌则无抑制作用。柠檬酸钠能缓和胆酸盐对肠道致病致病菌则无抑制作用。柠檬酸钠能缓和胆酸盐对肠道致病 菌的有害作用，并能中和煌绿和中性红等染料的毒性。菌的有害作用，并能中和煌绿和中性红等染料的毒性。中中 性红为指示剂，酸性时呈现红色，性红为指示剂，酸性时呈现红色，碱性时呈淡黄色。碱性时呈淡黄色。 大肠杆菌分解乳糖产酸，通过中性红显色，大肠杆菌分解乳糖产酸，通过中性红显色，菌落大而混浊，菌落大而混浊， 呈现红色呈现红色 志贺氏菌属和沙门氏菌属志贺氏菌属和沙门氏菌属的细菌不分解乳糖，而分解蛋白的细菌不分解乳糖，而分解蛋白

4、 质产生碱性物质，菌落形态为光滑微黄透明，园形、中等质产生碱性物质，菌落形态为光滑微黄透明，园形、中等 大小，边缘整齐的菌落。大小，边缘整齐的菌落。 由于由于宋内氏痢疾杆菌宋内氏痢疾杆菌有分解胆盐中的某些物质和发酵乳糖有分解胆盐中的某些物质和发酵乳糖 ( (产酸产酸) )较慢等特点，而使菌落呈淡红或红色、较大或边缘较慢等特点，而使菌落呈淡红或红色、较大或边缘 不整齐的扁平菌落。不整齐的扁平菌落。某些沙门氏菌属及变形杆菌某些沙门氏菌属及变形杆菌因因 产生产生 硫化氢，使菌落呈现黑色中心。硫化氢，使菌落呈现黑色中心。 伊红美兰琼脂培养基伊红美兰琼脂培养基(EMB)选择培养原理选择培养原理 此培养基

5、为弱选择性培养基。以此培养基为弱选择性培养基。以伊红美兰伊红美兰作指示作指示 剂剂 （）（）大肠杆菌大肠杆菌分解乳糖产酸时染上伊红，因为分解乳糖产酸时染上伊红，因为 伊红和美兰结合所以菌落不是红色而呈现伊红和美兰结合所以菌落不是红色而呈现紫黑色，紫黑色， 且有金属光泽且有金属光泽( (大肠杆菌大肠杆菌) )或棕色或棕色( (产气杆菌产气杆菌) )，扁，扁 平混浊、边缘色淡的菌落。平混浊、边缘色淡的菌落。 （）（）致病菌致病菌的菌落为无色半透明、园形，中等的菌落为无色半透明、园形，中等 大小，边缘整齐的菌落，在靠近大肠杆菌的可疑大小，边缘整齐的菌落，在靠近大肠杆菌的可疑 菌落往往呈现淡兰色。菌落

6、往往呈现淡兰色。 方法方法 1 1、分离培养、观察菌落特征：、分离培养、观察菌落特征：分别取大肠、分别取大肠、 痢疾杆菌培养物，用分离划线方法接种痢疾杆菌培养物，用分离划线方法接种SSSS 平板或平板或EMBEMB培养基培养基3737培养培养18-24h18-24h以后观察以后观察 结果（记录）。结果（记录）。 2 2、革兰染色、观察形态学特征：、革兰染色、观察形态学特征：取各菌培取各菌培 养物少许涂片，革兰染色、镜检（画图）。养物少许涂片，革兰染色、镜检（画图）。 SS或或EMB培养基生长现象观察培养基生长现象观察 （二）肠道杆菌生化反应及动力试验（二）肠道杆菌生化反应及动力试验 材料材料

7、1 1、菌种：大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、菌种：大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、 培养物培养物 2 2、培养基：克氏双糖斜面培养基、生化反、培养基：克氏双糖斜面培养基、生化反 应管、半固体培养基应管、半固体培养基 3 3、其他：接种环、接种针、酒精灯等。、其他：接种环、接种针、酒精灯等。 克氏双糖斜面培养基生化反应原理克氏双糖斜面培养基生化反应原理 该培养基含葡萄糖与乳糖的比例为该培养基含葡萄糖与乳糖的比例为1:101:10，并含硫酸亚铁和指，并含硫酸亚铁和指 示剂酚红。示剂酚红。 大肠杆菌大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，所以培养基呈黄色，发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，所以培养基呈黄色， 直立段

8、有气泡存在直立段有气泡存在 肠道病原菌肠道病原菌不能发酵乳糖，只能发酵葡萄糖，分解葡萄糖不能发酵乳糖，只能发酵葡萄糖，分解葡萄糖 产酸，使产酸，使PHPH下降，斜面部分先呈现黄色，由于葡萄糖含量下降，斜面部分先呈现黄色，由于葡萄糖含量 少，所生之酸接触空气而氧化，又因细菌的生长利用含氮少，所生之酸接触空气而氧化，又因细菌的生长利用含氮 物质生成碱性化合物，所以斜面部分后来又变成红色由物质生成碱性化合物，所以斜面部分后来又变成红色由 于直立段于直立段( (底层底层) )呈厌氧状态，细菌发酵葡萄糖所生的酸不呈厌氧状态，细菌发酵葡萄糖所生的酸不 被氧化，所以一直呈黄色。大肠杆菌产气，有动力被氧化，所

9、以一直呈黄色。大肠杆菌产气，有动力( (沿穿沿穿 刺线向周围扩散生长刺线向周围扩散生长) )伤寒杆菌有动力，而痢疾杆菌则没伤寒杆菌有动力，而痢疾杆菌则没 有动力有动力 某些细菌如变形杆菌，乙型副伤寒杆菌某些细菌如变形杆菌，乙型副伤寒杆菌能分解培养基中含能分解培养基中含 硫氨基酸（如胱氨酸）产生硫化氢、硫化氢与硫酸亚铁中硫氨基酸（如胱氨酸）产生硫化氢、硫化氢与硫酸亚铁中 的亚铁离子结合形成黑色的硫化铁，而的亚铁离子结合形成黑色的硫化铁，而痢疾杆菌痢疾杆菌不产生硫不产生硫 化铁化铁 方法方法 1 1、克氏双糖铁斜面培养基：、克氏双糖铁斜面培养基：分别取大肠杆菌、变形杆菌分别取大肠杆菌、变形杆菌 的

10、培养物，用穿刺加斜面划线接种方法接种于的培养物，用穿刺加斜面划线接种方法接种于2 2支克氏双支克氏双 糖斜面培养基，糖斜面培养基，3737培养培养18-24h18-24h以后观察结果。以后观察结果。 2 2、生化反应管：、生化反应管：取葡萄糖、乳糖等反应管，每种反应管取葡萄糖、乳糖等反应管，每种反应管 分别穿刺接种大肠杆菌、痢疾杆菌，分别穿刺接种大肠杆菌、痢疾杆菌，3737培养培养18-24h18-24h以后以后 观察结果。观察结果。 3 3、动力试验：、动力试验：分别取大肠杆菌、痢疾杆菌的培养物，用分别取大肠杆菌、痢疾杆菌的培养物，用 穿刺接种方法接种于穿刺接种方法接种于2 2支半固体培养培

11、养基，支半固体培养培养基，3737培养培养18-18- 24h24h以后观察结果。以后观察结果。 结果观察结果观察 肥达氏反应肥达氏反应 原理原理 用已知伤寒杆菌用已知伤寒杆菌O/HO/H抗原（抗原（TO/THTO/TH）和）和 甲乙型副伤寒杆菌甲乙型副伤寒杆菌H H抗原（抗原（PA/PBPA/PB）与患者）与患者 血清做定量凝集实验，以测定患者血清中血清做定量凝集实验，以测定患者血清中 有无相应抗体，根据抗体含量多少及增长有无相应抗体，根据抗体含量多少及增长 情况可辅助诊断伤寒及副伤寒。情况可辅助诊断伤寒及副伤寒。 2.2.材料材料 待检患者血清，待检患者血清，TO/TH/PA/PBTO/TH/PA/PB菌液，菌液， 生理盐水，试管，生理盐水，试管，1ml1ml吸管等。吸管等。 3. 方法 1234567 1.倍比稀释血清 0.5mlNS+0.5ml 血清 2.加四种菌液 （顺序：从后往 前） 3. 3718-24h 观察结果 TO TH PA PB 弃去 效价判断：以出现效价判断：以出现