线粒体疾病的分子诊断

1、线粒体疾病的分子诊断 Molecular diagnosis for mitochondrial related disorders 2 线粒体（Mitochondrion） 2 1. 1. 动物细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命动物细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命1010天天 2. 2. 每个细胞含几百到几千个线粒体每个细胞含几百到几千个线粒体 3. 3. 每个线粒体含每个线粒体含2-10 2-10 线粒体线粒体DNADNA（mtDNAmtDNA） 3 线粒体功能 Mitochondrial Disease.Chest 2001; 120:634648 ATP

2、脂肪酸代谢三羧酸循环氧化磷酸化 其他功能其他功能 储存钙离子储存钙离子 调节膜电位并控制细胞程序性死亡调节膜电位并控制细胞程序性死亡 细胞增殖与细胞代谢的调控细胞增殖与细胞代谢的调控 合成胆固醇及某些血红素合成胆固醇及某些血红素 Wikipedia 线粒体病线粒体病 Mitochondrial disordersMitochondrial disorders 发现发现- 1962 年， Lufe 等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢 率，同时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常。直到1988年， Wallace 等报道了首例由线粒体 DNA突变引起的人类疾病，明确了mtDNA

3、突 变可引起人类疾病。 定义定义- - 是遗传缺损引起线粒体代谢酶缺陷，致使ATP合成障碍、能量来源不足 导致的一组异质性病变，又称为线粒体细胞病。 发病率发病率- - 约为1:5000（约每5000人中1人发病） Smeitink 2006 线粒体病线粒体病 mitochondrial disordersmitochondrial disorders 是一组高度临床变异性和遗传异质性的疾病 线粒体蛋白 16,569 bp circular double stranded (mtDNA)20% 1,500 nuclear genes 80% （结构和功能） structural protein

4、 of the OXPHOS complexes protein required for assembly of OXPHOS complexes proteins involved in mtDNA translation proteins involved in mtDNA maintenance proteins involved in mitochondrial fusion and fission Douglas C. Wallace, 18171819 Shoubridge, 2001; Schapira，2000 进一步导致线粒体功能异常： 底物的运输缺陷； 底物的利用缺陷；

5、柠檬酸循环异常； 氧化磷酸化脱偶联； 呼吸链异常。 发病特点发病特点 v 核基因突变常染色体隐性、显性遗传或X-连锁遗传 （目前已鉴定的核基因突变约40种） v 线粒体基因突变母系遗传 （突变的mtDNA在母血增加，受累及的后代发病频率增加 ） mtDNA突变与临床表型之间关系复杂，主要表现为同一种mtDNA突变可以引发多种不同 的疾病表型，而同一种疾病表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导。 遗传异质性 婴幼儿起病较常见 编码线粒体结构蛋白的核基因突变编码线粒体结构蛋白的核基因突变 进行性外眼肌麻痹（PEO）、线粒体神经肠胃脑肌病、Leigh氏综合征 线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变线粒体

6、蛋白质翻译相关的核基因突变 2004年Miller等首次报道核基因编码的线粒体核糖体蛋白亚单位 16(MRPS16)纯合突变，导致先天畸形伴张力衰竭、四肢水肿、肝转氨酶活 性升高并乳酸亚基中毒症， 该女婴在出生后3天死亡。 核基因突变 线粒体基因突变 突变的影响： 引起呼吸链功能缺陷 氧化磷酸化酶异常 阈值效应：组织特异性 复制分离 母系遗传：不同突变后代发病风险不同。 相比A8344G突变，携带 A3243G突变的母系后代更容易发病 。 突变分布：同质性各器官组织分布相同 异质性不同组织、细胞分布不同 一般特点 同质性突变与异质性突变 11 线粒体基因线粒体基因 q同质性（同质性（Homop

7、lasmy） q0 或或 100% q异质性（异质性（Heteroplasmy） q 0-100% 核基因核基因 q纯合子（纯合子（Homozygous） q0 或或 100% q杂合子（杂合子（Heterozygous） q50% 线粒体基因突变 点突变点突变 目前已报道的mtDNA 点突变将近330种，涉及mtDNA编码的各个基因， 其中结构基因突变177种、tRNA基因突变137种、rRNA基因突变12种、D- Loop区突变2种 LHON、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征、肌阵挛癫痫、破碎 红纤维病、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等 重排重排 重排突变逾数百 遗传性痉挛性截瘫等 (

8、http： /) 线粒体疾病是复杂性疾病 遗传方式复杂遗传方式复杂 q常染色体隐性遗传（常染色体隐性遗传（Autosomal RecessiveAutosomal Recessive） q常染色体显性遗传（常染色体显性遗传（Autosomal DominantAutosomal Dominant） q性连锁遗传（性连锁遗传（Sex linkedSex linked） q母系遗传（母系遗传（Maternally inheritedMaternally inherited） 临床表型复杂临床表型复杂 q累及多系统（累及多系统（Multisystemic involve

9、mentMultisystemic involvement） q影响几乎所有组织器官（影响几乎所有组织器官（Any organ or Any organ or tissue can be affectedtissue can be affected） 13 线粒体病的共同临床特点 l 婴儿期发病： 常见于婴儿伴随COX阴性肌纤维、脑病和Leigh综合征。 l 儿童发病： 见于MELAS、MERRF、Leigh病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSS。 l 中枢神经系统损害： 共济失调、癫痫、肌张力下降、脊髓病等 l 周围神经损害： 交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征 l 视听神经损害

10、： 视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型 听力丧失出现在KSS l 肌肉病 见于线粒体肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹见于KSS和PEO （高度临床变异性 ） Chinnery et al. Lancet 2000 线粒体疾病的生化诊断 当一个患者的基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。当一个患者的基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。 代谢产物分析（血液、尿液、脑脊液等） 血液可以正常，但脑脊液多异常，（动脉比静脉好）；乳酸/丙酮酸比高(50:1) 提示呼吸链受到阻断。正常不除外线粒体疾病 酶测定 氧化磷酸化（OXPHOS）系统的酶活性测定。（wes

11、tern、比色法等）方法不稳定 一般情况下，血清CK正常或轻度升高；升高占30%见于慢性进行性眼外肌麻痹 ；mtDNA丢失时非常高。 肌肉活检 线粒体病的肌肉病理改变特点： （1）出现线粒体结构异常、细胞色素阴性肌纤维或RRF为主要病理改变。 （2）上述病理改变出现的频率高。 （3）缺乏其他的肌肉病理改变。 J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292 儿童及成人线粒体疾病的诊断标准儿童及成人线粒体疾病的诊断标准 A A 符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现 如KSS、CPEO、MELAS、MERRF 等； 多系统不明

12、原因发病多系统不明原因发病 必须至少三个系统出现临床症状必须至少三个系统出现临床症状 除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能 排除其它代谢和非代谢疾病排除其它代谢和非代谢疾病 B B 肌活检肌活检 在骨骼肌中存在在骨骼肌中存在2%2%破碎样红肌纤维破碎样红肌纤维 C C 有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现：有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现： 5050岁以下肌活检岁以下肌活检COXCOX阴性肌纤维阴性肌纤维2%2%； 50 50岁以上肌活检岁以上肌活检COXCOX阴性肌纤维阴性肌纤维5%5%； 任一组织种呼吸链酶活性任一组织种呼吸链

13、酶活性20%20%； 任一细胞系中呼吸链酶活性任一细胞系中呼吸链酶活性30%30%； 多于两组织内相同呼吸链酶活性多于两组织内相同呼吸链酶活性30%30%； 主要诊断标准 (Bernier et al, 2002)(3, 5) 次要诊断标准： A 症状符合线粒体脑肌病的临床表现；症状符合线粒体脑肌病的临床表现； 至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现： 3050岁肌活检RRF在1%2%； 30 岁以下肌活检出现RRF； 电镜下见广泛线粒体异常； B 至少一种呼吸链功能受抑制的表现：至少一种呼吸链功能受抑制的表现： 生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在20%30%； 用免疫方法证实呼吸链复合物表达

14、减少； C 发现可能相关的发现可能相关的mtDNA 异常；异常； D 一种或多种氧化磷酸化受损的表现：一种或多种氧化磷酸化受损的表现： 脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高； 若疑为KSS，脑脊液蛋白质增高； PET或31P-MRS证实肌肉或脑代谢降低； 最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低。 (Bernier et al, 2002)(3, 5) u 符合以上符合以上2 2个主要诊断指标或个主要诊断指标或1 1个主要诊断指标及个主要诊断指标及2 2个次要诊个次要诊 断指标的即为确诊线粒体病；断指标的即为确诊线粒体病； u 符合符合1 1个主要诊断指标及个主要诊断指标及1 1个次要诊断指

15、标或至少个次要诊断指标或至少3 3个次要诊个次要诊 断指标的为拟诊线粒体病；断指标的为拟诊线粒体病； u 符合符合1 1个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备1 1 个次要诊断指标的为疑诊线粒体病。个次要诊断指标的为疑诊线粒体病。 J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292 线粒体病诊断时应注意线粒体病诊断时应注意 基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体活性等相结合基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体活性等相结合 要区分病理性突变和正常衰老所致的线粒体基因突变要区分病理性突

16、变和正常衰老所致的线粒体基因突变 线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在量效关系线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在量效关系 散发与遗传的相关性散发与遗传的相关性 ，诊断是否遗传需排除环境、药物和衰老等因素，诊断是否遗传需排除环境、药物和衰老等因素 第一节 线粒体基因组与疾病 q线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组及其表达系统 qhttp:/http:/ q线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系 q线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异与疾病 20 21 q 人类线粒体基因组人类线粒体基因组 Light strand: 8 tRNA and 1 mR

17、NA (ND6) Heavy strand: 14 tRNA, 2 rRNA, and 12 mRNA Polycistronic with posttranscriptional processing 基因组小基因组小, 仅仅16569 bp 双链环状双链环状DNA 13 结构基因结构基因 / mRNA 22 tRNA 基因基因 2 rRNA 基因基因 12S rRNA 基因基因 16S rRNA 基因基因 非编码区非编码区 D-loop（约（约1120bp） L链复制起始区（约链复制起始区（约 3050bp，tRNAAsn- tRNACys） 高突变率高突变率 线粒体基因组及其表达系统 T

18、he two strands of mtDNA are differentiated by their nucleotide content with the guanine rich strand referred to as the heavy strand, and the cytosine rich strand referred to as the light strand. The heavy strand encodes 28 genes, and the light strand encodes 9 genes for a total of 37 genes. Of the 3

19、7 genes, 13 are for proteins (polypeptides), 22 are for transfer RNA (tRNA) and two are for the small and large subunits of ribosomal RNA (rRNA). 2 rRNAs Mitochondrial rRNA is encoded by MT-RNR1 (12S rRNA) MT-RNR2 (16S rRNA). Human mitochondrial DNA (mtDNA) has three promoters, H1, H2, and L (heavy

20、strand 1, heavy strand 2, and light strand promoters). The H1 promoter transcribes the entire heavy strand and The L promoter transcribes the entire light strand. The H2 promoter causes the transcription of the two mitochondrial rRNA molecules. The process of transcription initiation in mitochondria

21、 involves three types of proteins: the mitochondrial RNA polymerase (POLRMT), 2. mitochondrial transcription factor A (TFAM), 3. mitochondrial transcription factors B1 and B2 (TFB1M, TFB2M). 第一节 线粒体基因组与疾病 q线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组及其表达系统 q线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系 q线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异与疾病 26 核基因组

22、与线粒体基因组的相互作用 27 核基因组编码了核基因组编码了1500多个多个 线粒体蛋白线粒体蛋白 线粒体基因组只编码了线粒体基因组只编码了13条条 多肽链多肽链 “交叉对话（交叉对话（cross-talk）”机制机制 第一节 线粒体基因组与疾病 q线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组及其表达系统 q线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系 q线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异与疾病 q线粒体基因组变异线粒体基因组变异 q碱基突变：点突变。其中结构基因的点突变，与核基碱基突变：点突变。其中结构基因的点突变，与核基 因组一样，包括同义突变和错义突变因组一样，包

23、括同义突变和错义突变 q缺失与插入：缺失与插入： qmtDNAmtDNA拷贝数目突变：拷贝数目突变： q线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异与疾病 q耳聋，耳聋，LeberLeber遗传性视神经病变，糖尿病，高血压，遗传性视神经病变，糖尿病，高血压， 肿瘤肿瘤 28 29 在线粒体相关疾病中常见的DNA点突变 qMELASMELAS综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）：综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）： qA3243G (80%), T3271CA3243G (80%), T3271C（在（在tRNAtRNA Leu(UUR Leu(UUR) )基因） 基因） qMERR

24、FMERRF（肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维）：（肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维）： qA8344G (80%), T8356CA8344G (80%), T8356C（在（在tRNAtRNALys Lys基因） 基因） qLeberLeber视神经病（视神经病（LHONLHON）：）： qG11778AG11778A（在（在ND4ND4基因），基因），G3460AG3460A（在（在ND1ND1基因）基因） q耳聋（耳聋（DeafnessDeafness）: : qA1555G, T1494CA1555G, T1494C（在（在12S 12S rRNArRNA基因）基因） qA3243GA3243G（在

25、（在tRNAtRNALeu(UUR Leu(UUR) )基因） 基因） q2 2型糖尿病（型糖尿病（Type 2 DiabetesType 2 Diabetes）: : qA3243GA3243G（在（在tRNAtRNALeu(UUR Leu(UUR) )基因） 基因） qNARPNARP（共济失调伴色素性视网膜炎神经病）：（共济失调伴色素性视网膜炎神经病）： qT8993G, T8993CT8993G, T8993C（在（在ATPaseATPase 6 6 基因）基因） 线粒体病的分子诊断线粒体病的分子诊断 标本选择：标本选择： 外周血白细胞外周血白细胞最常用最常用 毛发毛发 唾液唾液 尿液

26、尿液 骨骼肌骨骼肌检测检测 mtDNAmtDNA分子诊断的最好标本分子诊断的最好标本 检测检测已知已知DNADNA突变的方法：突变的方法： 等位基因特异性寡核苷酸杂交（等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASOASO） 等位基因特异性扩增（等位基因特异性扩增（ASAASA） 限制性片段长度多态性分析（限制性片段长度多态性分析（PCR-RLFPPCR-RLFP） 连接酶链反应（连接酶链反应（LCRLCR） 基因芯片技术基因芯片技术 检测检测未知未知DNADNA突变的方法：突变的方法： 单链构象多态性（单链构象多态性（PCR-SSCPPCR-SSCP） 变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DEEGDEEG

27、） 异源双链分析（异源双链分析（HAHA） DNA DNA序列测序序列测序 变性高效液相色谱（变性高效液相色谱（DHPLCDHPLC） 分子诊 断方法 线粒体疾病中常见的突变 q核基因突变（核基因突变（nuclear gene mutationsnuclear gene mutations） q氧化磷酸化系统由核基因编码的蛋白质氧化磷酸化系统由核基因编码的蛋白质, , 例如例如: Surf1, : Surf1, SCO2, NDUFV1, NDUFS1,etc.SCO2, NDUFV1, NDUFS1,etc. q呼吸链缺陷呼吸链缺陷: : 重复、缺失重复、缺失 q线粒体线粒体DNADNA点突

28、变（点突变（mtDNA point mutationsmtDNA point mutations） qLHON, MELAS, MERRF, NARP, etc.LHON, MELAS, MERRF, NARP, etc. qmtDNAmtDNA缺失缺失/ /重复（重复（mtDNA mtDNA Deletions/duplicationsDeletions/duplications） qeg. KSS, Pearson synd, diabetes 而 野生型没有Apa的酶切位点, 故电泳 只能看到长度为553 bp的1 条片段 应用技术平台应用技术平台 Illumina GAllX 作为新一代分子生物学综合技术平 台，Genome Analyzer测序技术避免 了像传统测序技术那样耗费大量人力 、物力进行片段克隆、转化、质粒抽 提等工作，具有高准确性，高通量， 高灵敏度，低运行成本等突出优势， 是目前市