酶工程_03-动植物细胞培养产酶-2012

1、 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 概述 动物细胞动物细胞 无细胞壁，容易贴壁无细胞壁，容易贴壁 对营养要求严格（血清培养基）对营养要求严格（血清培养基） 对环境敏感（对环境敏感（pH、溶氧、温度、剪切应力）、溶氧、温度、剪切应力） 植物细胞植物细胞 有细胞壁，但比微生物的细胞壁脆弱有细胞壁，但比微生物的细胞壁脆弱 营养要求较动物细胞简单营养要求较动物细胞简单 生长缓慢，培养周期长，要达到高密度较困难生长缓慢，培养周期长，要达到高密度较困难 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 概述 植物细胞、动物细胞、微生物细胞培养的比

2、较植物细胞、动物细胞、微生物细胞培养的比较 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 概述 植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较 动物细胞、植物细胞和微生物细胞可以用相同方式培养动物细胞、植物细胞和微生物细胞可以用相同方式培养 动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感植物细胞和动物细胞对剪切力敏感 植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同 动物细胞动物细胞 蛋白疫苗、抗体、激素、酶（蛋白质或多肽）蛋白疫苗、

3、抗体、激素、酶（蛋白质或多肽） 植物细胞植物细胞 色素、香精、天然药物（小分子）、酶色素、香精、天然药物（小分子）、酶 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 本章主要内容 动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节 植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶 植物细胞及其培养特点植物细胞及其培养特点 植物细胞培养及产酶的工艺控制植物细胞培养及产酶的工艺控制 动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶 动物细胞及其培养特点动物细胞及其培养特点 动物细胞培养及产酶的工艺控制动物细胞培养及产酶的工艺控制 EnzymeEnzyme EngineeringEngineerin

4、g 动植物细胞中酶生物合成的调节 从基因到蛋白质从基因到蛋白质 有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植 物细胞物细胞 动植物细胞具有比微生物更多的调节方式动植物细胞具有比微生物更多的调节方式 转录水平调节转录水平调节 翻译水平调节翻译水平调节 DNA RNA Protein Active Enzyme 转转录录 逆逆转转录录 复复制制 翻翻译译 ？ 折折叠叠 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动植物细胞中酶生物合成的调节 细胞分化改变酶的生物合成细胞分化改变酶的生物合成 端粒（端粒（telomere

5、） 端粒是真核生物染色体的末端结构端粒是真核生物染色体的末端结构 由富含由富含 G、T 的的 DNA 简单重复序列不断重复而成简单重复序列不断重复而成 人端粒序列：人端粒序列：TTAGGG 保护真核生物染色体免遭破坏保护真核生物染色体免遭破坏 牺牲自我，填补牺牲自我，填补 DNA 复制后在复制后在 5-端留下的空隙端留下的空隙 端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短 端粒酶（端粒酶（telomerase） 催化端粒合成和延长催化端粒合成和延长 核糖核蛋白，其中的核糖核蛋白，其中的 RNA 部分含核苷酸模板序列，可构建端粒重部分含核苷酸模板序列，可构建端粒重 复序列复序列

6、端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动植物细胞中酶生物合成的调节 基因扩增加速酶的合成基因扩增加速酶的合成 通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶 段或细胞分化某一过程段或细胞分化某一过程 细胞的一种应急方式细胞的一种应急方式 基因扩增可以由基因扩增可以由 引起引起 耐药性细胞的抗药性产生耐药性细胞的抗药性产生 例：例：CHO 细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制，编码细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的

7、抑制，编码 这种酶的基因急剧扩增这种酶的基因急剧扩增 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动植物细胞中酶生物合成的调节 增强子促进酶的生物合成增强子促进酶的生物合成 增强子（增强子（modulator） 能高效增强或促进基因转录的一段能高效增强或促进基因转录的一段 DNA 序列序列 增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些 酶基因的表达酶基因的表达 具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同 EnzymeEnzyme Engi

8、neeringEngineering 动植物细胞中酶生物合成的调节 抗原诱导抗体酶的生物合成抗原诱导抗体酶的生物合成 抗体酶（抗体酶（abzyme）：催化性抗体，是）：催化性抗体，是 具有生物催化功能的抗体分子，是人具有生物催化功能的抗体分子，是人 工改造的对抗体可变区赋予催化特性工改造的对抗体可变区赋予催化特性 的特殊抗体的特殊抗体 修饰法修饰法 在抗体与抗原结合部位引进催化基团在抗体与抗原结合部位引进催化基团 诱导法（主要方法）诱导法（主要方法） 半抗原诱导半抗原诱导 酶蛋白诱导酶蛋白诱导 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 1902

9、年，年，Haberlandt 首次提出分离植物单细胞并培养成首次提出分离植物单细胞并培养成 植株的设想植株的设想 植物细胞的全能性植物细胞的全能性 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 植物细胞培养产酶种类植物细胞培养产酶种类 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 植物细胞结构植物细胞结构 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 植物细胞的主要特点植物细胞的主要特点 体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大 细

10、胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞， 营养要求较动物细胞简单营养要求较动物细胞简单 细胞生长及合成次级代谢产物需要细胞生长及合成次级代谢产物需要条件条件 主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物） EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 植物细胞培养的优势植物细胞培养的优势 提高目标物的产率提高目标物的产率 缩短生产周期缩短生产周期 木瓜蛋白酶：木瓜生长期木瓜蛋白酶：木瓜生长期 8 个月，木瓜细胞培养约个月，木瓜细胞培养约 1 个月个月 易于管理

11、，不受自然因素控制易于管理，不受自然因素控制 可以提高产物质量可以提高产物质量 通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染 缺点缺点 培养条件要求高培养条件要求高 光照、剪切力影响显著光照、剪切力影响显著 植物细胞生长缓慢植物细胞生长缓慢 相对于微生物相对于微生物 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 植物体外培养植物体外培养 胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶

12、植物细胞培养植物细胞培养 外植体选择和处理外植体选择和处理 外植体（外植体（explant） 从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植物组织片段或小从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植物组织片段或小 块块 根、茎、叶、芽、花、果实、种子等根、茎、叶、芽、花、果实、种子等 选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则 切片：切片：0.51 cm 消毒消毒 70% 乙醇乙醇 5% 次氯酸钠次氯酸钠 / 10% 漂白粉漂白粉 0.010.1% HgCl2 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 植物细胞培养植物

13、细胞培养 获取植物细胞：直接分离法获取植物细胞：直接分离法 直接分离法即直接从外植体中分离直接分离法即直接从外植体中分离 机械法机械法 将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞 质壁未分离；质壁未分离；，完整细胞数量少，完整细胞数量少 酶解法酶解法 利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代谢活性的细胞利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代谢活性的细胞 能降解细胞壁，必须对细胞给予能降解细胞壁，必须对细胞给予 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 植物细胞培养植物细胞培养 获取植物细胞：愈伤组织诱导法获取植物细

14、胞：愈伤组织诱导法 由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的的的 群体群体 本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助 伤口愈合的组织伤口愈合的组织 诱导过程诱导过程 配制半固体诱导培养基配制半固体诱导培养基 灭菌、植入外植体灭菌、植入外植体 13周后继代培养周后继代培养 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 植物细胞培养植物细胞培养 获取植物细胞：原生质体再生法获取植物细胞：原生质体再生法 一般采用酶解法分离原生质体，使用一般采

15、用酶解法分离原生质体，使用和和混合物混合物 保持溶液的保持溶液的 状态状态 防止原生质体胀裂防止原生质体胀裂 渗透压稳定剂：糖、盐、甘露醇、山梨醇等渗透压稳定剂：糖、盐、甘露醇、山梨醇等 原生质体培养，再生细胞壁原生质体培养，再生细胞壁 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 植物细胞培养植物细胞培养 悬浮培养悬浮培养 将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基 中进行培养的方法中进行培养的方法 悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组织，选择较松散的为宜悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组

16、织，选择较松散的为宜 植物细胞培养植物细胞培养 产物分离纯化产物分离纯化 收集培养液，从中获得所需的产物收集培养液，从中获得所需的产物 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 植物细胞培养基植物细胞培养基 水：一般用去离子水或蒸馏水水：一般用去离子水或蒸馏水 无机成分无机成分 大量元素：大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素：微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co 有机成分有机成分 碳源：糖，以碳源：糖，以 最常用最常用 氮源：氨基酸（氮源：氨基酸（Gly、Ala、Ser、Cys）及蛋白水解物、无机氮）及蛋白水解物、无机氮 维

17、生素：主要是维生素：主要是 B 族维生素和维生素族维生素和维生素 C 其他：肌醇、琼脂等其他：肌醇、琼脂等 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 常用的植物细胞培养基常用的植物细胞培养基 MS 培养基培养基 硝酸盐浓度较高，营养成分适宜，使用范围广硝酸盐浓度较高，营养成分适宜，使用范围广 B5 培养基培养基 NH4+ 浓度较低，适用于双子叶木本植物浓度较低，适用于双子叶木本植物 White 培养基培养基 无机盐浓度低，高无机盐浓度低，高Mg(II)、B(III)，适用于生根培养，适用于生根培养 KM-8P 培养基培养基 有机成分种类齐全，用于

18、原生质体培养有机成分种类齐全，用于原生质体培养 培养基配制培养基配制 配制母液，使用时按需要稀释配制母液，使用时按需要稀释 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 工艺条件及其控制（掌握要点，与微生物对比）工艺条件及其控制（掌握要点，与微生物对比） 温度温度 室温范围（室温范围（25 oC左右）左右） 最适产酶温度和最适生长温度不同最适产酶温度和最适生长温度不同 pH 微酸性（微酸性（pH 56） 细胞培养时，细胞培养时，pH一般变化不大一般变化不大 溶解氧溶解氧 植物细胞植物细胞，供氧不宜过量，供氧不宜过量 对剪切力敏感，通风搅拌不宜太剧烈对

19、剪切力敏感，通风搅拌不宜太剧烈 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 工艺条件及其控制工艺条件及其控制 光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响（植物特色）光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响（植物特色） 光照有时也抑制产物合成光照有时也抑制产物合成 添加前体添加前体 前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质 添加前体相对于添加了反应的底物添加前体相对于添加了反应的底物 刺激剂（刺激剂（elector） 引导物质朝特定的代谢方向进行，强化次级代谢产物的生物合成引导物质朝特定的代谢方向进行，强化次级代

20、谢产物的生物合成 常用微生物细胞壁碎片和胞外酶常用微生物细胞壁碎片和胞外酶 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 产酶实例产酶实例 大蒜细胞培养产大蒜细胞培养产 SOD 超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，EC 1.15.1.1） 生物体内清除超氧化物阴离子自由基（生物体内清除超氧化物阴离子自由基（O2-）的重要金属酶类）的重要金属酶类 SOD 和过氧化氢酶和过氧化氢酶 (catalase)、过氧化物酶、过氧化物酶 (peroxidase，POD) 一起构成了生物体内重要的酶促反应防御体系，从而维

21、护生物体内一起构成了生物体内重要的酶促反应防御体系，从而维护生物体内 细胞正常的生理代谢和生化反应细胞正常的生理代谢和生化反应 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 产酶实例产酶实例 大蒜细胞培养产大蒜细胞培养产 SOD 大蒜愈伤组织的诱导大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮 先用先用 70% 乙醇消毒乙醇消毒 20 s，再用，再用 0.1% 升汞消毒升汞消毒 10 min，然后无菌水，然后无菌水 漂洗漂洗 3 次次 在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成 0.5 cm3

22、的小块，植入含有的小块，植入含有 3 mg/L 2,4-D 和和 1.2 mg/L 6-BA 的半固体的半固体 MS 培养基中培养基中 25 oC，600 lux，12 h/d 光照条件下培养光照条件下培养 18 天，诱导得到愈伤组织，天，诱导得到愈伤组织， 每每 18 天继代一次天继代一次 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物细胞培养产酶 产酶实例产酶实例 大蒜细胞培养产大蒜细胞培养产 SOD 大蒜细胞悬浮培养大蒜细胞悬浮培养 将上述在半固体将上述在半固体 MS 培养基上培养培养基上培养 18 天的愈伤组织，在无菌条件天的愈伤组织，在无菌条件 下转入含

23、有下转入含有 3 mg/L 2,4-D 和和 1.2 mg/L 6-BA 的液体的液体 MS 培养基中，培养基中， 加入灭菌的玻璃珠，加入灭菌的玻璃珠，25 oC，600 lux，12 h/d 光照条件下振荡培养光照条件下振荡培养 1012 天，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞天，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞 无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有 3 mg/L 2,4-D 和和 1.2 mg/L 6-BA 的液体的液体 MS 培养基中，培养基中，25 oC，600 lux，12 h/d 光照条件下，振荡培养光照条件下，振荡培养 1

24、8 天天 SOD 分离纯化分离纯化 收集细胞，破碎，用收集细胞，破碎，用 pH 7.8 磷酸盐缓冲液提取磷酸盐缓冲液提取 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 1907年，年，Harrison 开创了动物组织培养的先河开创了动物组织培养的先河 从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，放在青蛙的凝固的淋巴液中培从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，放在青蛙的凝固的淋巴液中培 养，蝌蚪的神经组织存活了数周，并且从神经细胞中长出了神经养，蝌蚪的神经组织存活了数周，并且从神经细胞中长出了神经 纤维纤维 1950s，Earle 用动物细胞培养制取病毒疫苗用动物细胞培养制

25、取病毒疫苗 1967年，动物细胞贴壁培养微载体开发年，动物细胞贴壁培养微载体开发 1975年，杂交瘤技术年，杂交瘤技术 动物细胞可产生较高价值的物质动物细胞可产生较高价值的物质 激素、疫苗、单克隆抗体、酶激素、疫苗、单克隆抗体、酶 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 动物细胞结构动物细胞结构 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 动物细胞特性动物细胞特性 ，细胞脆弱（区别于植物和微生物），细胞脆弱（区别于植物和微生物） ，比微生物细胞大几千倍，但稍小于植物细胞，比微生物细胞大几千倍，但稍小

26、于植物细胞 在肌体内相互在肌体内相互，以群体形式存在，以群体形式存在 在培养时具有群体效应、在培养时具有群体效应、接触抑制性、功能全能性、接触抑制性、功能全能性 营养要求复杂（营养要求复杂（培养基）培养基） EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 动物细胞培养的特点动物细胞培养的特点 主要用于生产蛋白质主要用于生产蛋白质 生长缓慢生长缓慢 容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素 （胞外缺少保护结构）（胞外缺少保护结构） 大部分具有贴壁依赖性大部分具有贴壁依赖性 培养基成分复杂，价格高

27、昂培养基成分复杂，价格高昂 细胞生命有限，一般最多继代培养细胞生命有限，一般最多继代培养 50 代即退化死亡代即退化死亡 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 动物细胞培养方式动物细胞培养方式 悬浮培养悬浮培养 适用于非贴壁依赖型细胞适用于非贴壁依赖型细胞 、肿瘤细胞、体液（血液、淋巴、肿瘤细胞、体液（血液、淋巴 液）细胞液）细胞 类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件 有较大差别有较大差别 对通气、搅拌耐受性差对通气、搅拌耐受性差 对氧气的要求较微生物低，培养时需通入一对氧气的要求较微生物低，培养时需通

28、入一 定比例定比例 优点（相对于贴壁培养）优点（相对于贴壁培养） 细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好 传代培养容易，无需消化分散细胞传代培养容易，无需消化分散细胞 培养基中营养成分利用率高培养基中营养成分利用率高 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 动物细胞培养方式动物细胞培养方式 贴壁培养贴壁培养 适用于贴壁依赖型细胞适用于贴壁依赖型细胞 上皮细胞、成纤维细胞上皮细胞、成纤维细胞 细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂 滚瓶培养系统滚瓶培养系统 结构简单，但结构简单，但 微载

29、体培养系统微载体培养系统 由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球 兼具单层培养和悬浮培养的优势兼具单层培养和悬浮培养的优势 细胞生长环境均一细胞生长环境均一 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 动物细胞培养方式动物细胞培养方式 固定化培养固定化培养 贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用 吸附法吸附法 载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒 即属此类即属此类 包埋法包埋法 将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中将细胞包埋于琼脂、琼脂糖

30、、胶原及血纤维等海绵状基质中 细胞不易脱落细胞不易脱落 固定化培养优点固定化培养优点 细胞损伤程度低，可重复使用细胞损伤程度低，可重复使用 产物分离容易产物分离容易 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 动物细胞培养过程动物细胞培养过程 种质细胞种质细胞 体细胞（动物体内组织取出）体细胞（动物体内组织取出） 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 基本工艺过程基本工艺过程 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 动物细胞培养基动物细胞培养基 氨基酸：必需氨基酸，如氨基酸：必需氨基酸，如 等，作为碳源和能源利用等

31、，作为碳源和能源利用 维生素：维生素：B 族和维族和维 C，可由，可由 提供提供 无机盐：调节无机盐：调节 微量元素：微量元素：Fe、Cu、Zn 等，可由血清提供等，可由血清提供 葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸）葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸） 激素：胰岛素、生长激素、甾体激素等，可由血清提供激素：胰岛素、生长激素、甾体激素等，可由血清提供 生长因子：如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因生长因子：如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因 子等，一般来源于血清子等，一般来源于血清 培养基配制培养基配制 配制母液，使用前过滤除菌、稀释；配制母液，使用前过滤除菌、稀释； En

32、zymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 动物细胞培养的工艺条件及其控制动物细胞培养的工艺条件及其控制 温度温度 影响细胞生长，哺乳动物细胞：影响细胞生长，哺乳动物细胞：36.50.25 oC 影响影响 溶解度，从而影响培养液溶解度，从而影响培养液 值值 保持细胞内外等渗状态，一般保持细胞内外等渗状态，一般 700850 kPa 溶解氧溶解氧 供氧不足：细胞生长受抑制供氧不足：细胞生长受抑制 过量供氧：容易产生较多氧自由基，杀伤细胞过量供氧：容易产生较多氧自由基，杀伤细胞 用用代替空气（空气、代替空气（空气、O2、N2、） EnzymeEnzyme

33、EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 动物细胞培养的工艺条件及其控制动物细胞培养的工艺条件及其控制 pH 值与值与 CO2 浓度浓度 动物细胞培养液动物细胞培养液 pH 在在 7.07.6 之间，以之间，以 为最佳为最佳 最常用的缓冲体系为最常用的缓冲体系为 动物细胞培养时缺少动物细胞培养时缺少 CO2，培养液中的，培养液中的 HCO3- 会被耗尽；会被耗尽； 通常通常 CO2 浓度维持在浓度维持在 210% 之间之间 指示剂：酚红指示剂：酚红 CO2 + H2O H+ + HCO3- EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培

34、养产酶 动物细胞培养的工艺条件及其控制动物细胞培养的工艺条件及其控制 pH 值值 HEPES 缓冲体系缓冲体系 HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸羟乙基哌嗪乙磺酸 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-1-ethanesulfonic acid HEPES is a zwitter-ionic organic chemical buffering agent. HEPES is widely used in cell culture, largely because it is better at maintaining physiological pH despite

35、 changes in carbon dioxide concentration (produced by cellular respiration) when compared to bicarbonate buffers, which are also commonly used in cell culture. HEPES is like water in that its dissociation decreases as the temperature decreases. This makes HEPES a more effective buffering agent for m

36、aintaining enzyme structure and function at low temperatures. EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 相关问题相关问题 为什么培养的细胞要及时传代为什么培养的细胞要及时传代 传代培养：将原代培养的细胞分离、稀释并接种到新培养基上继传代培养：将原代培养的细胞分离、稀释并接种到新培养基上继 续扩大培养的阶段续扩大培养的阶段 体外培养的细胞大多具有体外培养的细胞大多具有的特性，也就是说当一个的特性，也就是说当一个 细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止

37、生长 当细胞铺满培养器皿表面时，正常细胞停止生长，但是转化（即当细胞铺满培养器皿表面时，正常细胞停止生长，但是转化（即 发生遗传物质突变）的、对接触抑制不敏感的细胞会继续生长发生遗传物质突变）的、对接触抑制不敏感的细胞会继续生长 如果不及时传代，这些如果不及时传代，这些，导，导 致正常细胞的退化致正常细胞的退化 ? EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 动物细胞培养产酶 产酶实例产酶实例 人黑色素瘤细胞培养生产人黑色素瘤细胞培养生产 tPA Tissue plasminogen activator (abbr. tPA) is a protein involved in the breakdown of blood clots. It is a serine protease (EC 3.4.21.68) found on endothelial cells, the cells that line the blood vessels. As an enzyme, it catalyzes the conversion of plasminogen to