乳酸脱氢酶制备

1、乳酸脱氢酶制备原理:乳酸脱氢酶( LDH)( )存在于具糖无氧代谢途径的细 胞中，为水溶性酶，催化如下反应：L (+)乳酸 +NAD f 丙酮酸 + NADH +H乳酸脱氢酶最早从牛心中分离并获结晶。 制备的方法为捣碎心肌 组织用水抽提，磷酸钙胶吸附，硫酸铵分级盐析及有机溶剂沉淀，最 后结晶出乳酸脱氢酶。乳酸脱氢酶活力检测原理是在 pHIO.O的条件下，LDH催化NAD 还原生成NADH NADH在 340nm有最大吸收，摩尔消光系数为 6.2 X 103, NADH勺分子量为663.44。LDH活力单位定义为：25 C、每分钟催化生成1微摩尔NADH的 酶量为1个活力单位。用紫外分光光度计测

2、定酶反应进程的 OD4。的增 量，可求出制备样品中的LDH活力。试剂：(1) CaCl 2 ?6H2O(2) Na 3PO4(3) 冰乙酸(4) 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液( pH7.2)(5) 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液( pH7.2)(6) 0.3 饱和度的硫酸铵溶液( 19.5g/100ml )(7) 丙酮（8） 硫酸铵粉末（9）0.5mol/L DL- 乳酸钠。（10）2mmol/L NAD容液：称取133mgNAD,溶于5ml蒸馏水中，加入约 0.15ml 1mol/L NaOH 调 pH为 6.0，定容 10ml，冰箱贮存。（11）0.1mol/L pH10.0 甘氨酸-氢

3、氧化钠缓冲液A液0.2mol/L甘氨酸溶液：称取15.01g甘氨酸用蒸馏水溶解，定容1L。B液0.2mol/L NaOH溶液：称取8gNaOH用蒸馏水溶解，定容1L。取100mlA液与64.0mlB液混合，蒸馏水定容 200ml。操作 ：一、磷酸钙胶制备（1）称取19.8g CaCl2?6HzQ 溶于150ml蒸馏水中，用自来水稀释 成 1600ml。（2）称取22.8g Na3PQ?12HQ溶于150ml蒸馏水中。（3）将两溶液混合，用冰乙酸调pH至7.4，室温下放置，使磷酸钙 胶沉淀。（4）吸去上清液，4000r/min离心3min,收集胶体备用。二、LDH 制备1、LDH水提取（1）取1

4、00g新鲜或短期冰冻保存的牛心，去除脂肪、血管，称重， 切成小块,低温下绞碎。（2）加入400ml冰冷的蒸馏水，冰浴中搅拌，提取 20min。(3) 4000r/min离心3min。吸出上清液，测量体积并记录。(4) 取样测定LDH舌力。2、磷酸钙胶吸附及洗脱( 5) 上 清液中加入磷酸钙胶 80g 左右，置冰浴中搅拌 15min。(6) 将胶悬浮液转入离心管中，3000r/min离心3min,弃去上清液， 保留磷酸钙胶。(7) 向磷酸钙胶沉淀中加入约 0.8 倍体积的 0.2mol/L 磷酸盐缓冲 液,于冰浴中充分搅拌 10 分钟。(8) 3000r/min离心3min，保留上清液。测量并记

5、录体积，取样测 定LDH活力。3、盐析(9) 将上清液置冰浴中冷却，搅拌下缓慢加入固体硫酸铵粉末，至0.6 饱和度(按 39g/100ml 比例加入)，冰浴中放置 10min。(10) 4000r/min离心5min，弃去上清液(11) 向沉淀中加入 20ml0.1mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液，使沉淀溶 解，测量并记录体积，取样测定 LDH活力。4 丙酮沉淀(12) 将溶液置冰浴中，缓慢加入 0.6倍体积(要准确)-20 C预冷 的丙酮，边加边轻轻搅匀，放置 10min。(13) 于4C4000r/min离心5min，弃去上清液。(14) 沉淀溶于适量蒸馏水，记录体积，测定LDH活力。三、LDH活力测定操作:(1)按下表在两只石英比色杯中分别加入以下试剂:甘AA缓冲液乳酸钠 NAD+蒸馏水LDH制备液空白2.7ml0.1ml0.1ml0.1ml-样品2.7ml0.1ml0.1ml0.09ml0.01ml(2)从样品杯中加入LDH制备液混匀的瞬时开始记时，测定酶反应30秒时的A值。结果：将各步骤测定的数据及计算结果填入下表并对制备工艺进行评价。 样品A 吸收值 V (ml)总体积 U