吉玛公司RNAi设计原则.doc

1、吉玛公司 RNAi 设计原则吉玛公司以国际上最先进的设计理念为依托，综合我们对 RNAi 文库筛选以及从客户反馈的结果，吉玛公司优先考虑的设计原则有以下几个方面：1. siRNA设计原则1.siRNA 双链末端的热稳定性，即的值2.siRNA 双链的反义链末端最后两个碱基的选择，即：20，21 位置碱基的选择3.siRNA 双链的反义链第1 和第 19 位置的碱基的选择4.siRNA 反义链的 G+C 的含量5.siRNA 反义链的第 2 位和第 18 位置的碱基的选择6.siRNA 反义链的第 2 位到 17 位局部稳定性的选择7.siRNA 双链的正义链为基准，整个双链稳定性的分布为，5末

2、端稳定性强，双链中间段，以断裂位点周围为例，稳定性较弱，3段稳定性较弱注：正义链 sense:19 碱基的靶点 +TT 悬头反义链 antisense:21 个碱基完全与靶点互补反义链最后两个碱基为脱氧核酸dNdN2.shRNA 设计原则shRNA 设计原则与 siRNA 设计原则相比有其特殊性。 源于 shRNA 的 siRNA 相对于外源导入的siRNA 在细胞内的有效浓度要低。 shRNA 末端设计以及双链的热稳定性是以 DNA 设计为基础，而 siRNA 是以 mRNA 为基础。1从转录本（ mRNA ）的 AUG 起始密码开始，寻找“AA 或者 NA ”二连序列，并记下其 3端的 1

3、9 个碱基序列，作为潜在的 siRNA 靶位点。正义链和反义链都采用这 19 个碱基 (不包括 AA 或者 NA 重复 )来设计。2避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。3siRNA 序列的 GC 含量应为 30%-60% 左右。4在设计 siRNA 时不要针对5和 3端的非编码区（ untranslatedregions ，UTRs ），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶复合物结合mRNA 从而影响siRNA 的效果。5将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。6将潜在的序列和相应

4、的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。例如使用BLAST （/BLAST/）。由于没有完整的基因组序列，比对起来相对困难。7 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA ，以找到最有效的siRNA 序列。8 阴性对照 :一个完整的 siRNA 实验应该有阴性对照， 作为阴性对照的siRNA应该和选中的 siRNA 序列有相同的组成，但是和mRNA 没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA 序列打乱，同样需要检查它和其他基因是否具有同源性。9有结果显示， UU 结尾和 dTdT 结尾的 si

5、RNA 在效果上没有区别，因为这个突出端无需和靶序列互补。 合成 siRNA 时可直接提供以AA 打头的 21 个碱基序列。siRNA 寡聚核苷酸设计原则siRNA 的设计是决定 RNAi 实验成败关键性的第一步。并非每个siRNA 都能有效引发基因沉默。和引物设计一样，设计有效的siRNA 也有一些经过前人经验总结出的规则，而且这些规则随着对siRNA 研究的深入也在不断完善之中。有一些开放的免费在线工具可用。付费的软件成功率比较高，3 个保证中 2 个。siRNA 的反义链 3端最好以 UU 结尾，这被公认是最有效的的siRNA 结构。现在以其他碱基结尾的siRNA 也有报道能成功引发RN

6、Ai ，你可以尝试。 不过如果是体外转录合成siRNA ，要避免以 G 结尾，因为后继处理时 RNase 会切除末端的 G。多个 siRNA 位点最好分散分布在mRNA 全长上。没有数据表明siRNA 在mRNA 上的前后位置和RNAi 效果有什么特别的关系。如果siRNA 位点因为mRNA二级结构或者蛋白结合的屏蔽而影响siRNA效果，分散分布可以减少风险。不过，也有报道说，如果可能，最好能避开起始的50 200个碱基，以避开潜在的调控蛋白结合位点。避开和其他基因同源序列， 以免“误伤群众”潜。在的目标序列都到这里BLAST一下， /BLAST，和其他

7、基因有 16 个以上碱基同源的序列一定枪毙掉。GC 比例 30%-50% 比高 GC 含量的 siRNA 的成功率要高些。有较多选择时留意，不要有连续 9 个以上的 GC ，也尽量避免出现连串的某个碱基。根据Schwards的文章，由于 siRNA 双链上只有一条链会结合RISC 上，究竟哪条链取决于RNA解旋酶，而正义链 5端以 GC 开头，且 5端 14 个碱基 GC 含量高，且 16 19位碱基 GC 含量低的序列 ,得到的 siRNA 反义链 5端 GC 含量低，3GC 含量高（也有研究表明反义链5端前 7 个碱基至少有 5 个 AU ），使得反义链比较容易正确结合 RISC ，因而基因沉默效果比较好。如果是 shRNA 表达载体，用的是RNA 聚合酶 III 类的启动子如 U6 ，最适合的结构是 5GN ，后面连续 4 个 U 结尾即可令转录终止，要避免序列中G，减出现连续的 U/A 。如果是自行设计siRNA 的话，