最新高效液相色谱使用方法.doc

1、最新高效液相色谱使用方法一、流动相准备将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解 性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。二、开机首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黃变绿打：打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。三、抽气抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至 Run,再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%,给0. 2ml/min的流速，听到泵转换的声音后， 将流速设为0,以抽取管路A的步骤进行抽气。四

2、、调节流动相比例与流速在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、l.Oml/min的速度逐步升高流速，每 次间隔3-5分钟。五、2410示差检测器的使用1、打开2410示差检测器开关2、调整检测器内、外温度3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结朿工作后不关机，节 省第二天的平衡时间，保持0. 2ml/min的流速。六、2487紫外检测器的使用1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。2、设置检测波长3、预热30分钟左右，即可注样测定。试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定一、样品准备取新鲜番茄根、茎、叶5克左右

3、，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80%甲醇，冰箱冷冻。二、提取样品放入预冷研钵，加10ml 80%的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小饶杯中，再用甲醇淸洗研钵2次, 每次10ml,转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱（04C）冷藏14小时以上。三、过滤取出用漏斗滤纸过滤，并用10ml80%甲醇淸洗残渣，合并滤液：如果提取液中沉淀物或色素多， 则用10000g离心1012min,上淸液转入冻干瓶中。四、浓缩将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干（至瓶中液体结冰），然后用2m 1 80%的甲醇冲洗，如果有浑浊 物，再次用离心机12000g离心lOmin,倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将 不足5ml的

4、试管中再加入一些甲醇。五、萃取提取液中加入等量石油礎萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程 反复进行，直至瞇层不再有颜色。六、过柱纯化萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用l2ml甲醇淸洗小柱一次，若滤出色素， 将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。七、二次浓缩液体转入蒸发皿中，60C蒸干，用hnl甲醇洗脱。八、过滤0. 45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测怎。九、测泄与计算用标样做标准曲线，分别为10, 50, 100, 200, 500mg/ml-J进样量为20ul。测定条件:流速为lml/mi

5、n,柱温设定为359,测定波长为260nm,流动相甲醇:3%乙醇=45：55汁算：通过曲线计算样品中激素浓度。试验五、葡萄糖、果糖、蔗糖含量的HPLC测定一、取样称取样品（番茄（甜瓜）果肉重12 g、叶肉（无大叶脉）2g） 一宜于试管（带玻璃试管塞）一倒入80% 乙醇，浸没样品约1 cm-80C水浴lh 冷却后封存。二、提取倒出乙醇提取液入25ml容虽瓶一再向试管中加入80%乙醇，80C水浴lh,如此反复提取次一合并提取 液后定容三、浓缩取10-25ml溶液，加入蒸发皿中，放置在水溶锅上蒸干备用。四、过滤用1ml超纯水将蒸发皿中的糖全部溶解，吸入lml注射器，过0.4卸m滤膜。若样品色素较多，

6、需通过C18小柱进行脱色，然后再过滤。C18小柱使用方法：C18柱：甲醇（5ml）一乙瞇（5ml） 80%乙醇（5ml）一样品80%乙醇（样品量的二倍）乙醴80%乙醇一样品80%乙醇五、HPLC测定测左方法及色谱条件为：Water600E髙效液相色谱，碳水化合物柱，柱温3O-35C, 2410示差检测器, 流动相比例为75%乙腊：25%超纯水，流速为1.0ml min1, Water Millennium软件控制及数据处理。试验六：蔗糖代谢酶的测定一、试剂的配置(先溶解、快到1升时调PH值)1、50m M HePesNaOH(PH7.5)缓冲液体系配置(1 升)50 m M HePes: 11

7、.9150gNaCl:16.0gkCl:0.74Na2HPO4.12H2O:0.543葡萄糖：2lmMEDTA:0372210 m M MgCl:203302.5 m M DTT :0.3856()10 m M Vc 1.76142 、PVPP個体3、0.1 M NaHPO4-柠檬酸(PH4.8 )0.2MNaHPO4 (35.8/500ml 9.86ml )O.IM 柠檬酸01g/L10.14ml )4、0.1 M NaHPO4-柠椽酸 PH： 7.20.2M NaHPO417.39 ml0M柠檬酸2.61 ml5、蔗糖：34229g定容至100 ml6、2N NaOH:8g NaOH 定容

8、至 100 ml7、30%HCl:39.5ml 浓 HCL 加入到 10.5 ml 水中8、0.1%间苯二酚：95%乙醇+0g间苯二酚左容至100 ml9、0.05M F-6-P0.2020g F-6-P+5 mlO.l N HC1 +数滴10%K2SO4至白色沉淀不在形成，10000g离心10分钟，弃沉 淀，上淸夜+1N NaOH 调 PH=7.010 ml10、UDPG： 0.205g/25mIlk Tris:0.1M,仅是 Tris,无盐酸12、5nM MgCb13、0.1N HCl:0.862 ml HC 定容至 100 ml14、0.05M 果糖.15、DNS试剂将6.3 gDNS和

9、262ml 2 M NaOH溶液，加到500 ml含有185g酒石酸钾钠的热水混液中,在加5g 结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸憾水定容至1000 ml,贮于棕色瓶中备用。二、样品测定lg样品冰浴研磨(加少量石英沙)計匀浆 四层纱+ 0.5g pvpp + 3mlHePES + 3mlHEPES + 4mlHepes布过滤 12000g(4C) 亍 弃沉淀 f 上淸夜+6. Og硫酸鞍(放置15分钟)f20分钟使之完全溶解12OOOg(4C)弃上清夜 3mlHepes溶解沉淀 移到透析20另钟袋中一用稀释10倍的Hcpcs(不含pvpp )4C培养箱中透析20小时(以上操作均在04C

10、下进行)、酸性，中性转化酶的测定（U mol Glucose h1 - g_1FW）1. 酸性转化酶0. 6ml （0. IM NacHPO-柠檬酸 PH4.8 + 0.2ml（0.1M 蔗糖）+ 0.2ml 酶提取液（透析后的）中性转化酶0. 6ml （0. IM KcHPO!柠檬酸 PH7.2 + 0.2ml（0.1M 蔗糖）+ 0.2ml 酶提取液（透析后的）2. 总体积为lml倣在小离心管中）37C孵育30分钟后 一转到试管中+lml蒸憎水+ 1.5ml 3,5-硝基水杨酸（DNS）空白2ml蒸馅水沸水浴5分钟 一流水冷却一每管中加21。5ml蒸懈水 一520mn比色。葡萄糖标准曲线0

11、12345678匍萄糖标准液（ml）00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馀水（ml）2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS 试剂(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5沸水浴5分钟，立即用自来水冷却蒸餾水（ml）21. 521. 521. 521. 521. 521. 521. 521. 521. 5OD520nm.蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性测定(u mol Sucrose IT QFW)1. 蔗糖合成酶0.1 ml(0.05M F6P)+0.1 ml(OOO82 g/ml UDPG)+0.lml(0.1 M Tris)+Oo

12、Iml(5mM MgCl2)+O.2ml 酶液蔗糖磷酸合成酶0ml(0.05M F6P)+0.1ml UDPG+0.1 ml(0.1M Tris)+O。lml(5niM MgCh)+0.2ml 酶液2. 上述反应在37C保温30分钟 lOCTC水浴1分钟一左容至lml调零lml蒸憾水+0.1ml(2N NaOH) 沸水浴10分钟 流水冷却 转到试管中+3.5ml(3O%HCl)+lml（0.1%间苯二酚）（用95%乙醇溶液） 摇匀 80C水浴10分钟 i水冷却_ 480nm 比色蔗糖标准曲线配制先配制200 u g/ml的蔗糖溶液0123456蔗糖标准液（ml）00.10.20.40.60.81.0加蒸馅