第五讲核酸的分子杂交13.10.)

1、第五讲第五讲 分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术 生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室 宋宋 方方 洲洲 2012013.13.1 0 0 在分子生物学操作上，分子杂交与印迹技在分子生物学操作上，分子杂交与印迹技 术实质上是术实质上是两个不同的技术两个不同的技术，下面首先予以，下面首先予以 单独介绍，然后介绍其关联和区分。单独介绍，然后介绍其关联和区分。 分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术 区别区别 1.1.杂交杂交(hybridization(hybridization） 从遗传的角度来说从遗传的角度来说, ,杂交指杂交指基因型不同的个体基因型不同的个体 之间进行的交配之

2、间进行的交配。 遗传学中经典的也是常用的实验方法。通过不遗传学中经典的也是常用的实验方法。通过不 同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因 重新组合的个体的方法。一般情况下，把通过重新组合的个体的方法。一般情况下，把通过生殖生殖 细胞相互融合而达到这一目的过程称为细胞相互融合而达到这一目的过程称为杂交杂交；而把；而把 由体细胞相互融合达到这一结果的过程称为体细胞由体细胞相互融合达到这一结果的过程称为体细胞 杂交。杂交。 一、分子杂交的概念一、分子杂交的概念 2.2.分子杂交（分子杂交（moleucularmoleucular hybridizat

3、ionhybridization） 分子杂交在分子生物学上一般即指核酸分子杂分子杂交在分子生物学上一般即指核酸分子杂 交，是指核酸分子在变性后再复性的过程中，来交，是指核酸分子在变性后再复性的过程中，来 源不同但互补配对的源不同但互补配对的DNADNA或或RNARNA单链（包括单链（包括DNADNA和和 DNADNA，DNADNA和和RNARNA和和RNARNA和和RNARNA）相互结合形成杂合）相互结合形成杂合 双链的特性或现象。双链的特性或现象。 依据此特性建立的一种对目的核酸分子进行依据此特性建立的一种对目的核酸分子进行 定性和定量分析的技术则称为定性和定量分析的技术则称为分子分子/核酸

4、分子杂核酸分子杂 交技术交技术(通常是将一种核酸单链用同位素或非同通常是将一种核酸单链用同位素或非同 位素标记即探针，再与另一种核酸单链进行分位素标记即探针，再与另一种核酸单链进行分 子杂交，通过对探针的检测而实现对未知核酸子杂交，通过对探针的检测而实现对未知核酸 分子的检测和分析分子的检测和分析)。 3.3.核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleic acid moleucularnucleic acid moleucular hybridizationhybridization）是指具有互补序列的两条核酸是指具有互补序列的两条核酸 单链单链在一定条件下按在一定条件下按碱基配对原则碱基配对原

5、则形成形成双链双链的过的过 程。杂交的双方分别称为程。杂交的双方分别称为探针探针与与待测核酸待测核酸，杂交，杂交 后形成的异源双链分子称为后形成的异源双链分子称为杂交分子杂交分子。 DNADNA杂交分子杂交分子 DNARNA杂交分子杂交分子 DNA分子分子DNA分子分子 复性复性 RNADNA 分子杂交分子杂交和和印迹技术印迹技术是目前生物医学研究中最是目前生物医学研究中最 为常用的基本分子生物学技术，在生物医学为常用的基本分子生物学技术，在生物医学基基 础研究础研究以及以及临床诊断临床诊断应用等方面广泛应用，譬应用等方面广泛应用，譬 如用于基因克隆的筛选、基因的定量和定性分如用于基因克隆的筛

6、选、基因的定量和定性分 析及基因突变的检测等。析及基因突变的检测等。 二、核酸分子杂交的用途二、核酸分子杂交的用途 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中应用最是目前生命科学研究领域中应用最 广泛的技术之一。广泛的技术之一。 用途：用途： 1.1.是是定性定性或或定量检测定量检测特异特异DNADNA或或RNARNA序列片段的有力工具；序列片段的有力工具； 2.2.在基因工程技术中，用放射性标记或非放射性标记的在基因工程技术中，用放射性标记或非放射性标记的 寡核苷酸或寡核苷酸或cDNAcDNA探针进行菌落杂交，探针进行菌落杂交，可从可从cDNAcDNA文库或基文库或基 因组文库

7、中筛选出特定的克隆，获得某一重组体；因组文库中筛选出特定的克隆，获得某一重组体； 3.3.用克隆化的用克隆化的DNADNA片段作探针进行片段作探针进行SouthernSouthern杂交杂交，可确，可确 定基因组定基因组DNADNA上上特定区域的核苷酸同源顺序特定区域的核苷酸同源顺序； 4.4.用用S1S1核酸酶或核酸酶或RNARNA酶消化酶消化DNADNA/ /RNARNA或者或者RNARNA/ /RNARNA杂交杂交 体是分析体是分析基因转录或基因转录或RNARNA加工加工的重要方法；的重要方法； 5.5.对某一已知基因或已克隆测序的基因可利用核酸对某一已知基因或已克隆测序的基因可利用核酸

8、 杂交技术进行染色体定位；杂交技术进行染色体定位； 6.6.可用于遗传病的可用于遗传病的基因诊断基因诊断，用于限制性片段长度，用于限制性片段长度 多态性作疾病的相关分析，基因连锁分析，多态性作疾病的相关分析，基因连锁分析，法医学法医学 上的上的性别分析和亲子鉴定性别分析和亲子鉴定。 7.7.在人类学研究中也有应用价值。在人类学研究中也有应用价值。 核酸分子杂交的基本原理是：核酸分子杂交的基本原理是：具有互补序列的两条单具有互补序列的两条单 链核酸分子在一定条件下链核酸分子在一定条件下（适宜的（适宜的温度温度及及离子强度离子强度等等 ）碱基互补配对结合，重新形成双链碱基互补配对结合，重新形成双链

9、；在这一过程中；在这一过程中 ，核酸分子经历了，核酸分子经历了变性变性和和复性复性的变化，以及复性过程的变化，以及复性过程 中分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是中分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是待测核酸待测核酸 序列和序列和已知核酸已知核酸序列。在杂交体系中序列。在杂交体系中已知已知的的核酸序列核酸序列 称作称作探针探针（probe ），探针通常用于进行核素或非核），探针通常用于进行核素或非核 素示踪标记。素示踪标记。 三、核酸分子杂交的原理三、核酸分子杂交的原理 探针的意义：探针的意义：要检测某一样品或基因组要检测某一样品或基因组DNADNA中特中特 定的定的DNADNA顺序或基因片段

10、，首先必须获得相应的顺序或基因片段，首先必须获得相应的 探针，即已知顺序的探针，即已知顺序的DNADNA或或RNARNA片段，并使它带上片段，并使它带上 可检测到的示踪可检测到的示踪标记标记。 A T C G G T A C A T T A G C C A T G T A 探针探针序列序列 待测样本待测样本序列序列 分子杂交的形式：分子杂交的形式： 固固液相杂交液相杂交 一般在进行某一核酸顺序的检测一般在进行某一核酸顺序的检测 时，先将待测的单链靶核酸时，先将待测的单链靶核酸固定在适当的载体固定在适当的载体上，然后置于上，然后置于 含相应单链核酸探针的含相应单链核酸探针的杂交反应体系杂交反应体

11、系中，通过碱基互补配对中，通过碱基互补配对 原则，两条单链的同源顺序通过氢键互相结合，形成双链结原则，两条单链的同源顺序通过氢键互相结合，形成双链结 构。经过对标记探针的检测可以判断待检测样品中相应顺序构。经过对标记探针的检测可以判断待检测样品中相应顺序 的的存在与否存在与否及及分子量大小分子量大小。 液相杂交液相杂交 有时也将待测核酸和已知核酸同时放有时也将待测核酸和已知核酸同时放 在在液体中液体中进行杂交反应。进行杂交反应。 两种杂交形式的两种杂交形式的基本原理都是一样的。基本原理都是一样的。 从发展历史来看从发展历史来看, ,先有先有液相杂交液相杂交, ,后有后有固固液相杂交液相杂交.

12、. 1.1.变性变性：在：在物理或化学因素物理或化学因素作用下，例如作用下，例如加热加热、酸酸 碱碱或或紫外线紫外线照射，可以导致两条照射，可以导致两条DNADNA链之间的链之间的氢键断氢键断 裂裂，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、 糖苷键等）则不受影响，称为糖苷键等）则不受影响，称为DNADNA变性变性（DNA DNA denaturationdenaturation）。）。 四、核酸分子杂交的过程四、核酸分子杂交的过程DNADNA的的变性变性与与复性复性 导致导致DNADNA变性的常用方法有三种：变性的常用方法有三种： 热变性热变性 碱变性

13、碱变性 化学试剂变性。化学试剂变性。 变性的情况：变性的情况： a. T70a. T700 0C C，DNADNA几乎不变性；几乎不变性； b. 70b. 700 0CT90CT90c. T900 0C C，DNADNA变性使双链打开，成为单链分子；变性使双链打开，成为单链分子； d .T100d .T1000 0C C，DNADNA双链分离。双链分离。 所以，一般核酸变性的温度都选在所以，一般核酸变性的温度都选在90901001000 0C C之间。之间。 （1 1）热变性）热变性：当升高核酸溶液的温度时，核酸当升高核酸溶液的温度时，核酸 双链间的氢键发生断裂，核酸的双链逐渐打开。双链间的氢

14、键发生断裂，核酸的双链逐渐打开。 （2 2）酸碱变性）酸碱变性：当核酸溶液的：当核酸溶液的pHpH低于低于3 3或高于或高于1010时，核时，核 酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子。在分子杂交酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子。在分子杂交 中，中，最常用最常用的核酸变性方法是的核酸变性方法是碱变性碱变性。因通常需要的核。因通常需要的核 酸的载体如酸的载体如凝胶凝胶或或膜膜对热都不稳定对热都不稳定。 （3 3）化学试剂变性）化学试剂变性：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂 如如尿素、甲醛尿素、甲醛等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核等时，两条链之间的

15、氢键可以断裂而形成单链核 酸分子。酸分子。 除物理、化学因素外，除物理、化学因素外，DNADNA分子的组成也影响变性。最主分子的组成也影响变性。最主 要的因素是要的因素是DNADNA分子中的分子中的GCGC含量，含量，GCGC含量高的含量高的DNADNA不易变性，而不易变性，而 ATAT含量高的含量高的DNADNA容易变性。容易变性。另外另外, ,环状环状DNADNA比线性比线性DNADNA难于变性难于变性. . DNADNA的变性是可逆的的变性是可逆的，即两条互补的单链，即两条互补的单链DNADNA分分 子在变性条件除去后子在变性条件除去后重新重新按碱基互补原则以氢键相按碱基互补原则以氢键相

16、 连连形成双链形成双链DNADNA分子分子，这一过程称作，这一过程称作DNADNA复性复性（DNA DNA renaturationrenaturation） 。 如果是如果是异源双链分子的结合异源双链分子的结合则称为则称为杂交杂交(hybridization) 。 相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补 核苷酸顺序的两条单股核酸链之间，如核苷酸顺序的两条单股核酸链之间，如DNA/DNA/DNADNA， DNA/DNA/RNARNA，RNA/RNA/RNARNA或人工合成的寡核苷酸片段与或人工合成的寡核苷酸片段与DNADNA、 RNARNA等。等。

17、 2.2.复性复性 1.1.核酸分子的浓度和长度：核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快；分子浓度越大，复性速度越快；分子 量越大，复性速度越慢。量越大，复性速度越慢。 一般情况下：探针浓度为一般情况下：探针浓度为0.10.10.5g0.5g；长度为；长度为5050300 bp300 bp 2.2.温度：温度：适宜温度为适宜温度为 比比TmTm值值低低 25250 0C C TmTm双链双链DNADNA变性一半所需要的温度变性一半所需要的温度(DNA(DNA的溶解温度，的溶解温度，meltingmelting temperature,Tm temperature,Tm） 3.3.离子强度

18、：离子强度： 低离子（低离子（NaNa+ +）强度下，核酸杂交非常缓慢，）强度下，核酸杂交非常缓慢， 离离 子强度增加，杂交反应率增提高。所以，必须维持较高的子强度增加，杂交反应率增提高。所以，必须维持较高的 杂交反应液和洗膜液的盐浓度杂交反应液和洗膜液的盐浓度 五、影响核酸分子杂交的因素五、影响核酸分子杂交的因素 核酸分子杂交实际上就是两条互补的单链核酸分子通过复性核酸分子杂交实际上就是两条互补的单链核酸分子通过复性 重新缔合形成双链的过程。这一过程受到重新缔合形成双链的过程。这一过程受到诸多因素诸多因素的影响。的影响。 4.4.杂交液中的甲酰胺：杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的甲酰

19、胺能降低核酸杂交的 TmTm值，从而使得：（值，从而使得：（1 1）在低温下探针更稳定；）在低温下探针更稳定； （2 2）能更好地保留非共价结合）能更好地保留非共价结合 的核酸。的核酸。 一般是：一般是：50%50%甲酰胺甲酰胺 353542420 0C C 5.5.核酸分子的复杂性：核酸分子的复杂性：不同顺序的总长度不同顺序的总长度( (碱基数）碱基数） 6.6.非特异性杂交反应：非特异性杂交反应： 须在杂交前封闭非特异性杂须在杂交前封闭非特异性杂 交位点，以减少其对探针的非特异性吸附作用交位点，以减少其对探针的非特异性吸附作用 1. Southern1. Southern印迹杂交（印迹杂交

20、（Southern blotSouthern blot） 鉴别鉴别DNADNA靶分子（待测核酸是靶分子（待测核酸是DNADNA） 六、核酸分子杂交的基本方法六、核酸分子杂交的基本方法 3. 3. 斑点杂交、斑点杂交、 4. 4. 原位杂交、原位杂交、 5. 5. 核酸酶保护实验等。核酸酶保护实验等。 2. Northern2. Northern印迹杂交（印迹杂交（Northern blotNorthern blot） 鉴别鉴别RNARNA靶分子（待测核酸是靶分子（待测核酸是RNARNA） 根据其用途可将核酸分子杂交分为几种基本类型：根据其用途可将核酸分子杂交分为几种基本类型： Southern

21、Southern印迹杂交印迹杂交是指是指DNADNA与与DNADNA的杂交，将电泳分的杂交，将电泳分 离的待测离的待测DNADNA片段转印并结合到一定的固相支持物片段转印并结合到一定的固相支持物 上，然后用标记的上，然后用标记的DNADNA探针检测待测探针检测待测DNADNA的一种方法。的一种方法。 这是这是19751975年英国爱丁堡大学的年英国爱丁堡大学的SouthernSouthern建立的方法，建立的方法， 因此而得名。因此而得名。 基本步骤：基本步骤： （一）（一）SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交 1.1.待测核酸样品的制备待测核酸样品的制备 （1 1）制备待测）制备

22、待测DNADNA：从样本的细胞或组织中制备从样本的细胞或组织中制备DNADNA （2 2）DNADNA的限制酶消化：的限制酶消化：将将DNADNA切割成大小不同的片段切割成大小不同的片段 2.2.待测待测DNADNA样品的电泳分离：样品的电泳分离：将将DNADNA样品在样品在0.80.81.0%1.0%琼脂琼脂 糖凝胶中电泳，以对糖凝胶中电泳，以对DNADNA片段进行分离（琼脂糖凝胶是由琼片段进行分离（琼脂糖凝胶是由琼 脂糖形成的网状物质，具有分子筛的作用，脂糖形成的网状物质，具有分子筛的作用，DNADNA因其分子大因其分子大 小小而在琼脂糖凝胶中的泳动而在琼脂糖凝胶中的泳动速度不同速度不同达

23、到分离）。达到分离）。 3.3.凝胶中核酸的变性：凝胶中核酸的变性：对凝胶中的对凝胶中的DNADNA进行碱变性，使其进行碱变性，使其 形成较短的单链片段。形成较短的单链片段。 4.Southern 4.Southern 转膜：转膜：将凝胶中的将凝胶中的DNADNA片段转移到硝酸纤维片段转移到硝酸纤维 膜（膜（NCNC）等固相支持物上。各个）等固相支持物上。各个DNADNA片段在膜上的相对位置片段在膜上的相对位置 与在凝胶中的相对位置是一样的，故称为与在凝胶中的相对位置是一样的，故称为印迹印迹（blotblot）。）。 （1 1）毛细管虹吸印迹法：）毛细管虹吸印迹法：利用浓盐转移缓冲液的推动利用

24、浓盐转移缓冲液的推动 作用，将凝胶中的作用，将凝胶中的DNADNA转移到固相支持物上。转移到固相支持物上。 （见下页图见下页图） （2 2）电转印法：通过电泳作用将凝胶中的）电转印法：通过电泳作用将凝胶中的DNADNA转移到滤转移到滤 膜上。膜上。 （3 3）真空转移法：其原理与毛细管虹吸印迹法相同。）真空转移法：其原理与毛细管虹吸印迹法相同。 Southern Southern 转膜的方法转膜的方法 重物重物 湿滤纸湿滤纸 吸水纸吸水纸 玻璃板玻璃板 胶胶 膜膜 湿滤纸湿滤纸 湿滤纸桥湿滤纸桥 支持平台支持平台 玻璃容器玻璃容器 20SSC 毛细管虹吸法毛细管虹吸法Southern转膜示意图

25、转膜示意图 5. 5. 探针的制备：探针的制备：用缺口平移或随机引物标记的方法用缺口平移或随机引物标记的方法 制备探针、标记。制备探针、标记。 7.7. 杂交结果的检测杂交结果的检测 （1 1） 放射线标记放射线标记放射自显影，感光胶片，显出黑放射自显影，感光胶片，显出黑 色杂交带；色杂交带； （2 2） 非放射线标记非放射线标记直接显出杂交带，进行检测。直接显出杂交带，进行检测。 6. Southern6. Southern杂交杂交 （1 1） 预杂交预杂交 封闭膜上所有能与封闭膜上所有能与DNADNA结合的位点转印后结合的位点转印后 的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）的膜在预杂交液（不含探

26、针的杂交液）4 46 6小时小时 （2 2） 杂交杂交 （过夜）（过夜） 分子杂交实验分子杂交实验过程过程 目目 录录 放放 射射 自自 显显 影影 照照 片片 目目 录录 分分 子子 杂杂 交交 电电 泳泳 图图 目目 录录 8.8.SouthernSouthern印迹杂交在医学中的应用印迹杂交在医学中的应用 SouthernSouthern印迹杂交技术已有印迹杂交技术已有3 30 0多年的历史，在多年的历史，在 核酸的结构和功能研究中作出过重要贡献。核酸的结构和功能研究中作出过重要贡献。 如：发现成熟如：发现成熟B B细胞中免疫球蛋白基因重排细胞中免疫球蛋白基因重排 现象；进行克隆基因的酶

27、切图谱分析；特定基现象；进行克隆基因的酶切图谱分析；特定基 因的定性和定量；因的定性和定量；DNADNA多态性多态性(RFLP,RAPD,AFLP(RFLP,RAPD,AFLP 等等) )分析分析 NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交是指将待测是指将待测RNARNA样品经电泳分离后样品经电泳分离后 转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行 固固液相杂交，以检测液相杂交，以检测RNARNA（主要是（主要是mRNAmRNA）的方法。其）的方法。其 基本原理和基本过程与基本原理和基本过程与SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交基本

28、相同基本相同。 只是在以下几点有所不同。只是在以下几点有所不同。 （二）（二）NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交 1. 1. 靶核酸靶核酸RNARNA 2. RNA2. RNA电泳电泳在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单 链线性状态）链线性状态） 3. 3. 转膜转膜电泳后不需要再进行变性和中和，直接用毛电泳后不需要再进行变性和中和，直接用毛 细管虹吸法细管虹吸法等方法转移。转移。 （三）斑点及狭缝印迹杂交（三）斑点及狭缝印迹杂交 特点：特点：简单、快速，可在同一张膜上同时进行多个简单、快速，可在同一张膜上同时进行多个 样品的检测；样品的检测；

29、 但不能鉴别分子量，且特异性不高，但不能鉴别分子量，且特异性不高， 有一定比例的假阳性。有一定比例的假阳性。 将将RNARNA或或DNADNA变性后变性后直接点样直接点样于硝酸纤维膜和尼龙于硝酸纤维膜和尼龙 膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定 量研究，称为量研究，称为斑点印迹斑点印迹( (dot blotdot blot) )。 如如印迹印迹是线状则为是线状则为狭缝印迹狭缝印迹或或狭线印迹狭线印迹( (slot slot blotblot） （四）原位杂交（四）原位杂交 核酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细核酸保持在细胞或组织样本

30、中，经适当的方法处理细 胞或组织后，将标记的核酸胞或组织后，将标记的核酸探针探针与与细胞或组织中的核酸细胞或组织中的核酸 进行进行杂交杂交，称为，称为原位杂交（原位杂交（in situin situ hybridization hybridization）。 这是一种标记这是一种标记DNADNA与整个染色体杂交并且发生杂交的与整个染色体杂交并且发生杂交的 区域可通过显微镜观察的技术。区域可通过显微镜观察的技术。 特点：特点： （1 1）不受组织成分的影响；不受组织成分的影响；（2 2）灵敏度高；灵敏度高；（3 3）可完可完 整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系及整保持细胞或组织形态

31、，准确反映组织细胞的相互关系及 功能；功能；（4 4）可检测多个探针。可检测多个探针。 核酸原位杂交包括核酸原位杂交包括组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲 洗洗及及信号检测信号检测等基本步骤。等基本步骤。 1. 1. 组织或细胞的固定组织或细胞的固定 2. 2. 组织细胞杂交前的预处理（预杂交）组织细胞杂交前的预处理（预杂交） 3. 3. 探针的选择和标记探针的选择和标记 4. 4. 杂交杂交 5. 5. 杂交结果检测杂交结果检测 重点介绍重点介绍荧光原位杂交荧光原位杂交 （fluorescence fluorescence in situin situ hybr

32、idization,FISH hybridization,FISH ） 概念：概念：液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于 杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成 杂交分子。杂交分子。 种类：种类： A. RNAA. RNA酶保护分析法酶保护分析法(RNase(RNase protection assay, RPA) protection assay, RPA) 用于用于mRNAmRNA定量、定量、mRNAmRNA末端定位及确定内含子在相应基末端定位及确定内含子在相应基 因中的位置等。因中的

33、位置等。 （五）液相杂交（五）液相杂交 1. 1. 制备待测制备待测RNA; 2. RNARNA; 2. RNA探针的标记探针的标记 3. 3. 杂交杂交; 4. ; 4. 除去单链除去单链RNARNA 5. 5. 电泳分析电泳分析 B.B.核酸酶核酸酶S1S1保护分析法保护分析法(nuclease S1 (nuclease S1 protection assay)protection assay) 用于基因转录起始位点分析及内含子剪切用于基因转录起始位点分析及内含子剪切 位点分析。位点分析。 其原理与其原理与RNARNA酶保护分析法类似酶保护分析法类似. . 分子杂交技术最早始于分子杂交技术

34、最早始于Benjamin HallBenjamin Hall等于等于 19611961年的探索，他将探针与靶序列在溶液中杂年的探索，他将探针与靶序列在溶液中杂 交，通过平衡密度梯度离心来分离杂交体，这交，通过平衡密度梯度离心来分离杂交体，这 实际为实际为液相杂交液相杂交。 由于杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去由于杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去 较为困难，同时误差较高且操作繁琐复杂，因较为困难，同时误差较高且操作繁琐复杂，因 此其应用较少。此其应用较少。 一般都用固固液相杂交液相杂交 1. cDNA1. cDNA探针探针：逆转录：逆转录 cDNA cDNA 克隆于载体克隆于载体 扩增重组扩

35、增重组 质粒质粒 提取质粒提取质粒 消化重组质粒消化重组质粒 切割切割cDNAcDNA片段片段 分离纯化分离纯化 cDNA cDNA探针探针 cDNAcDNA探针应用最广泛探针应用最广泛 2. 2. 基因组基因组DNADNA探针探针：从基因组文库：从基因组文库 筛选特定基因（或基筛选特定基因（或基 因片段）因片段） 克隆克隆 扩增扩增 纯化纯化 切取片段切取片段 分离纯化分离纯化 探针探针 3. 3. 寡核苷酸探针寡核苷酸探针：一定长度的寡核苷酸片段（十几个核苷酸：一定长度的寡核苷酸片段（十几个核苷酸 以上）以上） 4. RNA4. RNA探针探针：以：以RNARNA作为探针作为探针 （基因克

36、隆和体外转录获得）（基因克隆和体外转录获得） 七、探针的标记七、探针的标记 （一）探针的种类（一）探针的种类 1.1.核素标记物核素标记物一般用一般用-32 32P, P,但但55末端必须用末端必须用-32 32P P。 。 2.2.非核素标记物非核素标记物 （1 1）半抗原：）半抗原：生物素生物素(biotin)(biotin)和和地高辛地高辛(digoxin, digacin, DIG) （2 2）配体：）配体：生物素既是生物素既是半抗原半抗原，又是，又是亲和素亲和素( (avidinavidin， 抗生物素蛋白抗生物素蛋白) )，故可用生物素，故可用生物素- -亲和素反亲和素反 应进行杂

37、交信号检测应进行杂交信号检测 （3 3）荧光素：）荧光素：异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素( FITC)( FITC) （4 4）化学发光探针）化学发光探针 （二）标记物（二）标记物 1. 1. 缺口平移法缺口平移法(nick translation) (nick translation) (见图见图) ) 2. 2. 随机引物法随机引物法(randon(randon primer) primer) （见图）（见图） 3. PCR3. PCR标记法标记法 4. 4. 末端标记法末端标记法 （三）标记方法（三）标记方法 缺口平移法标记缺口平移法标记DNADNA探针探针 DNase；Mg2+ 5 3

38、模板模板DNADNA 35 5 3 3 随机打开缺口随机打开缺口 5 DNA聚合酶；聚合酶；-32P-dCTP；dNTPs 标记的探针标记的探针 随机引物法标记随机引物法标记DNADNA探针探针 5 3 模板模板DNADNA 35 5 3 变性变性 5 3 Klenow聚合酶；聚合酶；-32P-dCTP；dNTPs 变性变性 标记的探针标记的探针 随机引物随机引物 1.1.乙醇沉淀法乙醇沉淀法 2. Sephadex2. Sephadex G-50 G-50柱层析法柱层析法 3.3.微柱离心法微柱离心法 （四）探针的纯化（四）探针的纯化 印迹技术不仅可用于核酸的分子检测，也可以用印迹技术不仅可

39、用于核酸的分子检测，也可以用 于蛋白质的检测。蛋白质在电泳分离之后也可以转于蛋白质的检测。蛋白质在电泳分离之后也可以转 移并固定于膜上，相对应于移并固定于膜上，相对应于DNADNA的的SouthernSouthern印迹和印迹和 RNARNA的的NorthernNorthern印迹，该印迹方法则被称为印迹，该印迹方法则被称为WesternWestern 印迹印迹（Western blotWestern blot或或Western blottingWestern blotting）或）或蛋白蛋白 印迹印迹。 八、八、WesternWestern印迹印迹 蛋白质印迹技术的过程与蛋白质印迹技术的过程

40、与DNADNA和和RNARNA的印迹技术基本类的印迹技术基本类 似，但也有很多似，但也有很多不同之处不同之处，譬如，譬如Western BlotWestern Blot是采用变是采用变 性聚丙烯酰胺性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离凝胶电泳进行蛋白质分离，利用，利用免疫学的免疫学的 抗原抗原- -抗体反应来检测被转印的蛋白质抗体反应来检测被转印的蛋白质，被检测物是蛋，被检测物是蛋 白质，白质，“探针探针”是抗体是抗体，“显色显色”用标记的二抗。因为用标记的二抗。因为 蛋白质印迹技术涉及到利用免疫学的抗原蛋白质印迹技术涉及到利用免疫学的抗原- -抗体反应来抗体反应来 检测被转印的蛋白质，故也被称

41、为检测被转印的蛋白质，故也被称为免疫印迹技术免疫印迹技术 （immunoimmuno-blotting-blotting）。）。 Western blot 原理：原理： WesternWestern印迹的基本步骤：印迹的基本步骤： 1 1蛋白质样品的制备：蛋白质样品的制备： 根据样品的组织来源、细胞类型和待测蛋白质的性质来根据样品的组织来源、细胞类型和待测蛋白质的性质来 选择合适的蛋白质样品制备方法。不同来源的组织、细胞、选择合适的蛋白质样品制备方法。不同来源的组织、细胞、 目标蛋白，蛋白质样品的制备方法也不仅相同。譬如细菌、目标蛋白，蛋白质样品的制备方法也不仅相同。譬如细菌、 酵母、组织培养

42、的哺乳动物细胞、哺乳动物组织来源的蛋酵母、组织培养的哺乳动物细胞、哺乳动物组织来源的蛋 白质样品制备的方法明显不同，膜蛋白、核蛋白和可溶性白质样品制备的方法明显不同，膜蛋白、核蛋白和可溶性 蛋白的制备方法也明显不同。蛋白质样品制备好后可用蛋白的制备方法也明显不同。蛋白质样品制备好后可用 BradfordBradford比色法、比色法、LowryLowry法、二喹啉甲酸（法、二喹啉甲酸（BCABCA）比色法等）比色法等 来测定蛋白质浓度，其中以来测定蛋白质浓度，其中以BradfordBradford比色法最为常用。比色法最为常用。 2 2蛋白质样品的分离：蛋白质样品的分离： 主要采用不连续主要采

43、用不连续SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（PAGEPAGE） 电泳对蛋白质样品按照分子量大小进行分离。通常电泳对蛋白质样品按照分子量大小进行分离。通常 同时使用强阴离子去污剂同时使用强阴离子去污剂SDSSDS与某一还原剂（如巯与某一还原剂（如巯 基乙醇），并通过加热使蛋白质变性解离成单个的基乙醇），并通过加热使蛋白质变性解离成单个的 亚基后再加样于电泳凝胶上。亚基后再加样于电泳凝胶上。 3 3转印：转印： 将经过电泳分离的蛋白质样品转移到固相膜将经过电泳分离的蛋白质样品转移到固相膜 载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳

44、分离的多肽类型及其生物学活性且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性 不变。不变。 转印方法主要采用电转印法，主要有水浴式电转印方法主要采用电转印法，主要有水浴式电 转印即湿转和半干式转印两种方式。转印即湿转和半干式转印两种方式。 4 4检测与结果分析：检测与结果分析： 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗 体起免疫反应，再与辣根过氧化物酶标记的第二抗体起体起免疫反应，再与辣根过氧化物酶标记的第二抗体起 反应，最后通过化学发光来检测目的蛋白的有无和所在反应，最后通过化学发光来检测目的蛋白的有无和所在 位置及分子量大小。位置及分子量大小。

45、需要注意的是，在进行抗原需要注意的是，在进行抗原- -抗体反应之前，一般需抗体反应之前，一般需 用去脂奶粉等作为封闭剂对固相膜载体和一些无关蛋白用去脂奶粉等作为封闭剂对固相膜载体和一些无关蛋白 质的潜在结合位点进行封闭处理，以降低背景信号和非质的潜在结合位点进行封闭处理，以降低背景信号和非 特异性结合。特异性结合。 作为分子生物学的经典实验方法，该技术已经被作为分子生物学的经典实验方法，该技术已经被广泛广泛 应用于分子医学领域用于检测蛋白水平的表达应用于分子医学领域用于检测蛋白水平的表达，是当代是当代 分析和鉴定蛋白质的最有效的技术之一分析和鉴定蛋白质的最有效的技术之一。这一技术的灵。这一技术

46、的灵 敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需像敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需像 免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。此外，免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。此外， 由于蛋白质的电泳分离几乎总在变性条件下进行，因此，由于蛋白质的电泳分离几乎总在变性条件下进行，因此， 也不存在溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等也不存在溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等 诸多问题。诸多问题。 印迹技术的类别及应用印迹技术的类别及应用 （一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNADNA、重组质粒和噬菌体的、重组

47、质粒和噬菌体的 分析。分析。 （二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) 用于用于RNARNA的定性定量分析的定性定量分析。 （三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 Western Blot 图片图片 western blot 结果：结果： GAPDH Bmi-1 M 1 2 3 4 5 6 Bmi-1 - actin Con GFPsi Bmi-1si M: Marker ; 1, 2: MCF-7/Bmi-1si (Bmi-1si); 3, 4:

48、 MCF-7/GFPsi (GFPsi); 5, 6: MCF-7 (con) 博士论文答辩博士论文答辩 western blot p53 Bcl-2 Bax pAkt(ser473) tAkt -actin 1 2 3 4 5 6 沉默沉默Bmi-1基因对相关蛋白表达的影响基因对相关蛋白表达的影响 1, MCF-7; 2, MCF-7+DOX; 3, MCF-7/GFPsi; 4, MCF-7/GFPsi+DOX; 5, MCF-7/Bmi-1si; 6, MCF-7/Bmi-1si + DOX。 博士论文答辩博士论文答辩 WB检测检测-arrestin1/2 蛋白水平的变化蛋白水平的变化

49、Fig 2-1. 骨髓中骨髓中-arrestin1/2 蛋白水平的变化蛋白水平的变化 Vs NL, *P0.01 * * * * * * Fig 2-2. 外周血中外周血中-arrestin1/2 蛋白水平的变化蛋白水平的变化 Vs NL, *P0.01 * * * * * * 三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较 九、荧光原位杂交（九、荧光原位杂交（FISH）技术）技术 及其在医学上的应用及其在医学上的应用 （一）荧光原位杂交技术的概念（一）荧光原位杂交技术的概念 荧光原位杂交荧光原位杂交 (Fluorescence (Fluorescence in situ in situ hybridi

50、zation , FISH) FISH) 是一种在放射性原位杂交基础上发展起来的非放射是一种在放射性原位杂交基础上发展起来的非放射 性原位杂交技术，是把性原位杂交技术，是把生物素生物素或或地高辛地高辛(DIG)(DIG)等标记等标记 物质标记的物质标记的DNADNA片段作为片段作为探针探针（probeprobe），与染色体），与染色体 DNADNA进行进行分子杂交分子杂交，利用，利用荧光色素荧光色素为检测信号，在为检测信号，在荧荧 光显微镜光显微镜下直接检测探针互补的下直接检测探针互补的DNADNA片段的存在部位。片段的存在部位。 实际上是分子生物学与细胞生物学交叉结合而实际上是分子生物学与细

51、胞生物学交叉结合而 形成的一种现代生物技术，属于形成的一种现代生物技术，属于分子细胞生物学分子细胞生物学 的范畴。的范畴。 FISHFISH技术技术现已成为现已成为分子生物学分子生物学与与分子细胞遗传分子细胞遗传 学学研究中的重要手段。研究中的重要手段。 （二）（二）FISHFISH的基本原理的基本原理 依据依据碱基互补碱基互补原理，将原理，将DNADNA探针用特殊修饰的核苷探针用特殊修饰的核苷 酸酸分子标记分子标记（如（如biotin-dUTPbiotin-dUTP或或digoxigenin-dUTPdigoxigenin-dUTP），）， 然后将标记然后将标记探针直接探针直接杂交杂交到染色

52、体或到染色体或DNADNA纤维切片上，纤维切片上， 再通过直接再通过直接检测检测（荧光素直接标记的探针）或用荧光（荧光素直接标记的探针）或用荧光 素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来间素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来间 接检测接检测DNADNA在染色体或在染色体或DNADNA纤维上的定位。纤维上的定位。 FISHFISH基于基于免疫组织化学免疫组织化学（抗原抗体反应，即与荧光（抗原抗体反应，即与荧光 素偶联的抗体和抗原结合）与素偶联的抗体和抗原结合）与分子杂交分子杂交原理。原理。 （三）用于（三）用于FISHFISH的探针类型的探针类型 a. a. 着丝粒探针着丝粒探针(c

53、entromeric(centromeric probe) probe) b. b. 全染色体或染色体区带特异性探针全染色体或染色体区带特异性探针 (whole chromosome or region-specific probe)(whole chromosome or region-specific probe) c. c. 染色体特异性单一序列探针（染色体特异性单一序列探针（unique sequence unique sequence probe probe ，USPUSP） d. d. 端粒染色体探针端粒染色体探针(telomeric(telomeric chromosome pr

54、obes chromosome probes 探针探针DNA染色体标本染色体标本 切口平移法切口平移法 前处理前处理 探针探针DNA变性变性 染色体染色体DNADNA变性变性 单链单链DNA 单链单链DNADNA 用用PI、DAPI对染色体染色对染色体染色 （四）荧光原位杂交（四）荧光原位杂交（FISHFISH）示意图）示意图 探针探针DNA与染色体与染色体DNA分子杂交分子杂交 用抗生物素蛋白用抗生物素蛋白荧光素处理荧光素处理 找出杂交信号找出杂交信号 用荧光显微镜观察用荧光显微镜观察 生物素（地高辛）标记生物素（地高辛）标记 （五）（五）FISHFISH衍生技术衍生技术 随着分子生物学实验

55、技术的不断发展随着分子生物学实验技术的不断发展,FISH,FISH技术也技术也 在不断发展，已形成了一系列衍生技术在不断发展，已形成了一系列衍生技术: : 1. 1. 染色体涂染染色体涂染(chromosomal painting)(chromosomal painting)技术技术 2.2.多彩色荧光原位杂交多彩色荧光原位杂交(multicolor-FISH) (multicolor-FISH) 又称多色涂染技术又称多色涂染技术(multiplex-FISH )(multiplex-FISH ) 双色双色FISHFISH图图 双色双色FISHFISH图图 多色多色FISHFISH图图 4.4.基因组原位杂交基因组原位杂交 (genomic (genomic in situ in situ hybridization,hybridization, GISH)GISH) 3.3.引物原位引物原位DNADNA合成合成 (primed(primed in situ in situ DNA systhesisDNA systhesis, PRINS, PRINS） 5.5.比较基因组原位杂交（比较基因组原位杂交（CGHCGH） 由于由于FISHFISH具有安全、经济、灵敏快速和精具有安全、经济、灵敏快速和精 确等优点，它