实验一小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集、运动能力检测与结构观察[重要知识]

1、任课教师：吴雨龙任课教师：吴雨龙 任课班级：任课班级：0707级级 实验九实验九 小鼠睾丸、附睾及输精管精小鼠睾丸、附睾及输精管精 子采集、运动能力检测与结构观察子采集、运动能力检测与结构观察 实验九实验九 小鼠睾丸、附睾及输精管精小鼠睾丸、附睾及输精管精 子采集、运动能力检测与结构观察子采集、运动能力检测与结构观察 1 重点辅导 1. 1.认识雄性小鼠睾丸、附睾、输精管等认识雄性小鼠睾丸、附睾、输精管等 生殖器官结构及位置特点；生殖器官结构及位置特点； 2.2.掌握小鼠睾丸、附睾及输精管精子采掌握小鼠睾丸、附睾及输精管精子采 集方法；集方法； 3.3.掌握血细胞计数板法精子计数和运动掌握血细

2、胞计数板法精子计数和运动 能力检查的方法；能力检查的方法； 4.4.通过睾丸、附睾及输精管精子运动能通过睾丸、附睾及输精管精子运动能 力检测，认识精子在睾丸产生后，在力检测，认识精子在睾丸产生后，在 附睾内成熟的过程；附睾内成熟的过程； 实验目的实验目的 2 重点辅导 5. 5. 掌握精子抹片方法；掌握精子抹片方法； 6. 6. 掌握染色法进行精子结构观察和顶体掌握染色法进行精子结构观察和顶体 结构观察的方法，认识精子的正常结构；结构观察的方法，认识精子的正常结构； 7. 7. 使学生得到小鼠精子操作的基础训练。使学生得到小鼠精子操作的基础训练。 实验目的实验目的 3 重点辅导 哺乳动物的精子

3、哺乳动物的精子在睾丸内形成，并必须经过在睾丸内形成，并必须经过 在附睾内发生一系列形态、生理和生化方面的在附睾内发生一系列形态、生理和生化方面的 变化而最终达到成熟，才能获得向前运动的能变化而最终达到成熟，才能获得向前运动的能 力，这种向前运动能力的获得是精子受精能力力，这种向前运动能力的获得是精子受精能力 的重要指标。哺乳动物精子包括头部和尾部两的重要指标。哺乳动物精子包括头部和尾部两 个主要部分，颈部介于头部和尾部之间，形成个主要部分，颈部介于头部和尾部之间，形成 头部和尾部的连接。精子头部主要由核组成，头部和尾部的连接。精子头部主要由核组成， 实验原理实验原理 4 重点辅导 头部顶端是顶

4、体，顶体包围核的前端形成帽状。头部顶端是顶体，顶体包围核的前端形成帽状。 精子颈部变细并形成头部和尾部的连接。尾部精子颈部变细并形成头部和尾部的连接。尾部 是精子的运动器官，可以分为中段、主段和末是精子的运动器官，可以分为中段、主段和末 端。端。 实验原理实验原理 5 重点辅导 1. 1. 设备与器材：设备与器材：实体显微镜、恒温培养箱、实体显微镜、恒温培养箱、 恒温水浴锅、注射器、注射针头、吸管、恒温水浴锅、注射器、注射针头、吸管、 试管试管架、血细胞计数板、剪刀、解剖刀、架、血细胞计数板、剪刀、解剖刀、 解剖镊、载玻片、盖玻片等。解剖镊、载玻片、盖玻片等。 实验用品实验用品 2. 2. 药

5、品、试剂：药品、试剂： 精子操作液（精子操作液（CZB液或液或KSOM液）、液）、0.5%龙龙 胆紫酒精液、胆紫酒精液、36%甲醛溶液、磷酸缓冲液甲醛溶液、磷酸缓冲液 （PH6.8）、精子固定液（福尔马林磷酸盐）、精子固定液（福尔马林磷酸盐 缓冲液）、吉姆萨工作液。缓冲液）、吉姆萨工作液。 6 重点辅导 实验用品实验用品 3. 3. 实验动物：实验动物： 选择选择60日龄以上，体重达到日龄以上，体重达到32-35g的昆明种的昆明种 公鼠。公鼠。 7 重点辅导 1. 1. 精子采集：精子采集： 左手捏小鼠尾部，右手持镊子，或以图左手捏小鼠尾部，右手持镊子，或以图3-13-1所所 示方法，以颈部脱

6、臼法处死小鼠。使处死的小鼠示方法，以颈部脱臼法处死小鼠。使处死的小鼠 仰卧，用仰卧，用75%75%的酒精棉球消毒腹部开口部位被毛的酒精棉球消毒腹部开口部位被毛 及皮肤。剪开腹壁，暴露生殖系统。无菌分离睾及皮肤。剪开腹壁，暴露生殖系统。无菌分离睾 丸、附睾及输精管。在含培养液的表面皿中，用丸、附睾及输精管。在含培养液的表面皿中，用 眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂 肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨 碍精子观察。碍精子观察。 实验方法实验方法 8 重点辅导 将分离并清洗干净的睾丸、附睾及输精管，

7、用眼将分离并清洗干净的睾丸、附睾及输精管，用眼 科剪再分离为睾丸、附睾尾及附带的小段输精管、科剪再分离为睾丸、附睾尾及附带的小段输精管、 其余部分的输精管其余部分的输精管3 3部分，弃去附睾头。采集睾丸部分，弃去附睾头。采集睾丸 精子时，将睾丸横切为如干段或组织块，放在表精子时，将睾丸横切为如干段或组织块，放在表 面皿中，加面皿中，加1ml1ml培养液，用眼科剪轻轻挤压睾丸组培养液，用眼科剪轻轻挤压睾丸组 织块，把精子挤入培养液中，去掉组织块。置织块，把精子挤入培养液中，去掉组织块。置 3737、5%CO5%CO2 2、饱和湿度培养箱孵育、饱和湿度培养箱孵育20min20min，使，使 精子自

8、行散开。精子自行散开。 实验方法实验方法 9 重点辅导 实验方法实验方法 采集附睾尾精子时，将其剪成几段。采集输精管采集附睾尾精子时，将其剪成几段。采集输精管 精子时，由于小鼠输精管非常细，不能直接冲洗精子时，由于小鼠输精管非常细，不能直接冲洗 管腔，将输精管放入含有管腔，将输精管放入含有1ml1ml培培养液的表面皿内，养液的表面皿内， 在实体显微镜下，用一只眼科异物针固定输精管，在实体显微镜下，用一只眼科异物针固定输精管， 用另一支异物针向相反方向纵向撕开输精管，精用另一支异物针向相反方向纵向撕开输精管，精 子会浮游到培养液中。将大块输精管组织拨开，子会浮游到培养液中。将大块输精管组织拨开，

9、 用吸管连同精子吸出液体部分，装于用吸管连同精子吸出液体部分，装于2ml具塞试具塞试 管中暂存。管中暂存。 10 重点辅导 2. 2. 精子运动能力检查：精子运动能力检查： 用滴管吸取精液，放于血细胞计数板的计数用滴管吸取精液，放于血细胞计数板的计数 室与盖玻片接触处，使精液自然流入计数室中。室与盖玻片接触处，使精液自然流入计数室中。 计数中间计数中间5 5个中方格（对角个中方格（对角5 5个或四角及中间）内个或四角及中间）内 8080个小方格的精子数，计数值为个小方格的精子数，计数值为X X0 0计算时，先计计算时，先计 数死精子的数死精子的X X1 1值，然后计数板置于值，然后计数板置于5

10、050水浴锅中水浴锅中 的搪瓷盘中，在的搪瓷盘中，在50 50 条件下条件下5 510min10min杀死精子，杀死精子， 计数总精子数计数总精子数X X2 2值，（值，（ X X2 2 X X1 1 ）/ X/ X2 2为表示精子为表示精子 运动能力的精子活力值。计数时每份精子用运动能力的精子活力值。计数时每份精子用3 3个计个计 数板重复计数数板重复计数3 3次，取平均值。次，取平均值。 实验方法实验方法 11 重点辅导 3. 3. 精子整体结构观察：精子整体结构观察： 取取1 1小滴保存精液在载玻片上，将样品滴以拉小滴保存精液在载玻片上，将样品滴以拉 的形式制成抹片。用的形式制成抹片。用

11、0.5%0.5%龙胆紫酒精液染色龙胆紫酒精液染色3min3min， 自然干燥，水洗后镜检。镜下可观察到大多数为自然干燥，水洗后镜检。镜下可观察到大多数为 结构正常的精子，部分为结构正常的精子，部分为畸形精子畸形精子，如，如头部畸形头部畸形 （如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不明显、（如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不明显、 皱缩、缺损、双头等）、颈部畸形皱缩、缺损、双头等）、颈部畸形 实验方法实验方法 12 重点辅导 3. 3. 精子整体结构观察：精子整体结构观察： （颈部膨大、纤细、屈折、不全、双体等）、尾（颈部膨大、纤细、屈折、不全、双体等）、尾 部中段畸形（膨大、纤细、弯曲、屈折、不

12、全、部中段畸形（膨大、纤细、弯曲、屈折、不全、 双体等）、尾部主段畸形，然后分类计数。有的双体等）、尾部主段畸形，然后分类计数。有的 精子尾部发育未完成，为未成熟精子，可计为畸精子尾部发育未完成，为未成熟精子，可计为畸 形精子。形精子。 实验方法实验方法 13 重点辅导 4. 4. 精子顶体结构观察：精子顶体结构观察： 精液抹片自然干燥精液抹片自然干燥101020min20min，以，以1 1 2ml2ml的福的福 尔马林磷酸缓冲液固定尔马林磷酸缓冲液固定15min,15min,水洗后自然干燥。水洗后自然干燥。 用姬姆萨工作液染色用姬姆萨工作液染色90min90min，水洗，风干。置于，水洗，

13、风干。置于 10001000倍显微镜下用油镜观察，计数顶体异常精子。倍显微镜下用油镜观察，计数顶体异常精子。 镜下可观察到大多数精子镜下可观察到大多数精子顶体结构正常顶体结构正常，部分精，部分精 子子顶体异常顶体异常，精子顶体异常主要表现为肿胀、缺，精子顶体异常主要表现为肿胀、缺 损、部分或完全脱落。损、部分或完全脱落。 实验方法实验方法 14 重点辅导 剖开小鼠腹腔时，剪刀头要向上，以避剖开小鼠腹腔时，剪刀头要向上，以避 免剪破腹腔血管和内脏，影响实验结果的免剪破腹腔血管和内脏，影响实验结果的 观察。观察。 实验注意事项实验注意事项 15 重点辅导 实验结果及分析实验结果及分析 1. 1.雄性小鼠的生殖器官主要由哪几个部分组成？雄性小鼠的生殖器官主要由哪几个部分组成？ 2.2.绘制小鼠精子结构图？绘制小鼠精子结构图？ 3.3