基因扩增与重排讲述

1、基因扩增与基因重排基因扩增与基因重排 遗传学遗传学 基因扩增的定义: 基因扩增（gene amplification):细胞内某些特 定基因的拷贝数专一性的增加,它是细胞在短 期内为满足某种需要而产生足够基因产物的 一种调控手段。 v为满足正常的生长发育为满足正常的生长发育 两栖类和昆虫的卵母细胞两栖类和昆虫的卵母细胞rRNA基因的扩增基因的扩增 果蝇滤泡细胞卵壳蛋白的基因扩增现象果蝇滤泡细胞卵壳蛋白的基因扩增现象 v外界环境因素引起的基因扩增外界环境因素引起的基因扩增 药物诱导抗药性基因的扩增药物诱导抗药性基因的扩增 肿瘤细胞中原癌基因拷贝数异常增加肿瘤细胞中原癌基因拷贝数异常增加 许多致癌

2、剂可诱导许多致癌剂可诱导DNA扩增扩增 体细胞体细胞 rDNA 500拷贝拷贝 1.爪蟾卵细胞内的rRNA(rDNA)的扩增 注：注： rDNA：基因组中编码核糖体RNA（rRNA） 分子的对应的DNA序列。 rRNA：rDNA的转录产物，它是构成核糖体 的重要成分，核糖体由许多小的rRNA分子组装而成。 卵细胞卵细胞 rDNA 约约2000000拷贝 真核细胞真核细胞rRNA基因为串联重复序列基因为串联重复序列: 由由18S、5.8S和和28SrRNA基因组成一个转录单位基因组成一个转录单位, 彼此间隔分开彼此间隔分开,重复单位之间的间隔重复单位之间的间隔DNA序列不转序列不转 录录. 由于

3、间隔区中的串联重复次数不同，由于间隔区中的串联重复次数不同， 因此，不同间隔区的长短差异很大。因此，不同间隔区的长短差异很大。 0 20 40 60 80 100 120 一月二月三月四月 亚洲区 欧洲区 北美区 生物生物 重复单位长度重复单位长度非转录间隔区长度非转录间隔区长度 转录区长度转录区长度 酿酒酵母 黑腹果蝇 非洲爪蟾 小鼠 8950 1150014200 1050013500 4400 1750 37506450 23005300 30000 7200 7750 7875 13400 rRNA基因簇串联重复单位的不同长度基因簇串联重复单位的不同长度 单位：bp 5SrRNA基因在

4、基因组中呈串联重复排列成基因簇。基因在基因组中呈串联重复排列成基因簇。5S基因基因 与非转录间隔区相间排列，组成一个重复单位。在爪蟾体细与非转录间隔区相间排列，组成一个重复单位。在爪蟾体细 胞中胞中5SrRNA基因约有基因约有500拷贝，而在卵细胞中拷贝，而在卵细胞中5S基因可重基因可重 复复20000多次。这大概是为了和卵细胞中大量扩增的多次。这大概是为了和卵细胞中大量扩增的28S和和 18S基因相统一。基因相统一。5SrRNA基因没有基因扩增现象基因没有基因扩增现象 rDNA的扩增的扩增 rDNA是采用是采用滚环式复制滚环式复制方式在核仁区进行的方式在核仁区进行的 扩增，扩增产生的新扩增，

5、扩增产生的新rDNA不纳入线形染色体不纳入线形染色体 中，而是一环状小中，而是一环状小DNA分子方式存分子方式存在。在。 滚环式复制：双链DNA环状分子先在一条单链的复制起点上产生一个切口(nick)，然 后以另一条单链为模板不断地合成新的单链。释放出的新合成的单链或是先复制 成双链DNA，被酶切割成单位长度后，再形成环状双链DNA分子；或是释放出 的新合成的单链DNA，先被酶切割成单位长度形成单链环状DNA分子后再复制 成双链环状DNA分子。 果蝇在卵巢成熟之前，卵巢颗粒细胞中的卵壳 蛋白基因被扩增。果蝇的卵母细胞经过4次分裂， 形成1个卵母细胞和15个营养细胞（为卵母细胞 提供蛋白质及其它

6、营养）。营养细胞通过胞浆 桥与卵细胞相连，使营养物质顺利进入正在增 大的卵细胞。多次特殊的DNA复制，卵壳蛋白 等基因拷贝数显著增加。 2. 果蝇滤泡细胞卵壳蛋白的基因扩增现象果蝇滤泡细胞卵壳蛋白的基因扩增现象 DNA不切离的多次扩增形成复制泡的网状结构不切离的多次扩增形成复制泡的网状结构 外界环境因素引起的基因扩增外界环境因素引起的基因扩增 1.在培养的动物细胞中在培养的动物细胞中,已知对双氧叶酸还原酶已知对双氧叶酸还原酶(DHFR) 的抑制剂甲氨蝶呤的抑制剂甲氨蝶呤(methotrexate)具有耐药性的细具有耐药性的细 胞胞,其其dhfr基因增加达基因增加达1000个拷贝个拷贝,这已使用

7、于对基这已使用于对基 因扩增机制的分析等因扩增机制的分析等. 2.细胞受到药物攻击后细胞受到药物攻击后,为抵抗药物作用为抵抗药物作用,需产生抗性需产生抗性 基因的产物基因的产物去破坏它去破坏它,最直接有效的办法是大量最直接有效的办法是大量增加增加 抗性基因的数目抗性基因的数目,使抗性基因的产物随之大量增加使抗性基因的产物随之大量增加. v基因扩增是基因表达增加的一种重要机理。 v基因扩增与抗药性有关。 基因重排 v定义:DNA分子的核苷酸序列的重新排布,序列 的重排可形成新的基因,还可调节基因的表达. 通过基因的转座，DNA的断裂错接而使正常 基因顺序发生改变。 基因重排 v 定向重排与变换

8、v非定向重排 定向重排与变换 定向重排可使一个基因从远离其启动子的位 置移到启动子附近位点而被启动。 基因表达的变换 环境条件引起的基因变化 小鼠免疫球蛋白结构基因的表达 当免疫细胞分化时，当免疫细胞分化时，染色体定向重排染色体定向重排把把3个远离的基因连在一起，个远离的基因连在一起，因因 由于由于V、C、J基因的不同组合造成了抗体的多样性。基因的不同组合造成了抗体的多样性。 基因表达的变换 由于DNA片段缺失片段缺失使调控区和新基因受体连连 接成新调控启动基因接成新调控启动基因，使原来无活性基因转 变为有活性。（如（如酵母细胞性别的转换酵母细胞性别的转换） 酵母菌的生活周期酵母菌的生活周期

9、a 单倍体 a 单倍体 a 单倍体 单倍体 单倍体 单倍体 a / 二倍体 M A T a M A T a M A T M A T M A T a M A T a M A T M A T a 因子 因子 受体 受体 性因子与 受体接合 接合 二倍体形成 子囊形成 酵母菌的生活史和细胞特征酵母菌的生活史和细胞特征 v1. 酵母菌的生活史和细胞特征酵母菌的生活史和细胞特征 单倍体细胞单倍体细胞 二倍体细胞二倍体细胞 单倍体细胞单倍体细胞 v2. 酵母的接合型转换酵母的接合型转换 a细胞细胞 细胞细胞 细胞细胞 a细胞细胞 v3. 酵母细胞接合型决定因子基因结构及表达酵母细胞接合型决定因子基因结构及

10、表达 HML, HMR, MAT, HO; 信号传递和调控基因信号传递和调控基因 v4. 酵母接合型转换模型酵母接合型转换模型-磁带模型磁带模型 活动磁带盒和沉默磁带盒活动磁带盒和沉默磁带盒 接合型控制的几种活性接合型控制的几种活性 酵母接合型转换模型酵母接合型转换模型-磁带模型磁带模型 S l ie n t c a s s e t t eA c ti v e c a s s e t t eS l ie n t c a s s e t t e F r e q u e n t F r e q u e n t H M LM A TH M R aa H M LM A TH M R a H M LM

11、A TH M R aa H M LM A TH M R aa HML和和HMR两个基因贮存了两种接合型等位基因，两个基因贮存了两种接合型等位基因，当转座当转座 给给MAT基因座时就发生了接合型的转换。基因座时就发生了接合型的转换。因此，因此，MAT基因座基因座 是通过转座而转换其接合型的。是通过转座而转换其接合型的。MAT基因座的序列转换成另基因座的序列转换成另 一个基因的序列，一个基因的序列， 非定向重排非定向重排 例如转座子在染色体上的移动，转座子的插例如转座子在染色体上的移动，转座子的插 入可激活或抑制某些基因。如顺向末端重复入可激活或抑制某些基因。如顺向末端重复 序列的转座可能导致某些

12、片段的缺失而使启序列的转座可能导致某些片段的缺失而使启 动子邻近结构基因而使其转录。动子邻近结构基因而使其转录。 环境因素也引起基因重排环境因素也引起基因重排 改变环境温度、水分和改变环境温度、水分和pH等条件，可使植物等条件，可使植物 改变了的表型得到遗传。环境引起的稳定变改变了的表型得到遗传。环境引起的稳定变 异很可能起因于某些异很可能起因于某些DNA序列的不等复制、序列的不等复制、 不等变换或某些染色体外因子导致的基因重不等变换或某些染色体外因子导致的基因重 排。排。 总结总结 v基因重排重排广泛存在于动物、植物和微生物的体基因重排重排广泛存在于动物、植物和微生物的体 细胞基因组中细胞基

13、因组中; v基因重排可能导致基因重排可能导致DNA顺序的变化，顺序的变化，DNA的扩增、的扩增、 丢失或修饰；丢失或修饰； v基因重排可能产生新基因，用于特定环境中的表达，基因重排可能产生新基因，用于特定环境中的表达， 如动物的免疫球蛋白；如动物的免疫球蛋白； v基因重排可能是改变已有基因的表达模式，用于调基因重排可能是改变已有基因的表达模式，用于调 控其他基因的表达。控其他基因的表达。 DNA重排技术 DNA重排又叫有性重排又叫有性PCR、分子杂交等、分子杂交等,是一种反复是一种反复 性突变、重组过程性突变、重组过程,它是它是将一组紧密相关的核酸序列将一组紧密相关的核酸序列 随机片段化随机片

14、段化,这些片段通过自配对这些片段通过自配对PCR或重组装或重组装 PCR延伸延伸,最后组装成一个完整的全长核酸序列最后组装成一个完整的全长核酸序列,在在 这个过程中就引入了突变并进行了重组这个过程中就引入了突变并进行了重组,这样通过这样通过 核酸序列的迅速进化核酸序列的迅速进化,就可提高核酸序列或其编码就可提高核酸序列或其编码 的蛋白的功能。的蛋白的功能。 DNA重排技术步骤 v目的目的DNA片段的获得片段的获得 v随机片段化随机片段化 v重组装重组装PCR/无引物无引物PCR v筛选或选择筛选或选择 基因重排技术的应用 v单基因的定向改造；单基因的定向改造； v序列相关基因的重排；序列相关基

15、因的重排； v生物代谢途径的改造；生物代谢途径的改造； v对整个基因组的改造对整个基因组的改造 利用利用DNA重排技术已经成功地对许多单基因重排技术已经成功地对许多单基因 如工业用酶、抗体以及一些重要蛋白等进行如工业用酶、抗体以及一些重要蛋白等进行 了定向改造了定向改造,使酶活性、底物特异性以及抗体使酶活性、底物特异性以及抗体 亲和性、蛋白的功能、热稳定性等得到了明亲和性、蛋白的功能、热稳定性等得到了明 显提高显提高, DNA重排既可以对单一代谢途径进行优化重排既可以对单一代谢途径进行优化,又又 可以同时对多个代谢途径进行组合性改造可以同时对多个代谢途径进行组合性改造,形形 成多样性的合成途径

16、成多样性的合成途径,导致生物小分子多样性导致生物小分子多样性 的出现的出现,产生产生“非天然非天然”的天然小分子文库的天然小分子文库,用用 于先导化合物的筛选于先导化合物的筛选 展望 DNA重排目前已经可以在单一基因、单一代谢途径甚至整重排目前已经可以在单一基因、单一代谢途径甚至整 个基因组等各个层面用于体外进化个基因组等各个层面用于体外进化,如果与合适的选择或筛选如果与合适的选择或筛选 压力结合压力结合,将在多方面特别是医药方面得到广泛应用。如用将在多方面特别是医药方面得到广泛应用。如用 于于DNA序列的改造序列的改造,可以提供更好的可以提供更好的DNA疫苗、蛋白表达、疫苗、蛋白表达、 基因治疗、转基因载体基因治疗、转基因载体;用于特定蛋白的改造用于特定蛋白的改造,可以提供特异可以提供