第十章 植物种质的超低温保存

1、第十章第十章 植物种质的超低温保存植物种质的超低温保存 种质保存的概念 种质保存：利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有的遗传 物质保持其完整性，有高的活力，能通过 繁殖将其遗传特性传递下去。 种质保存的途径 种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠 害侵扰。 种植保存：占地多，管理费用高。 离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导 致培养物的染色体和基因型的变异；费用较高 超低温冷冻保存：在液氮超低温下保存种质的 技术。应用前景广阔。 一、离体保存方法 使保存种质处于缓慢生长或无生长状态， 需要时可迅速恢复生长。 抑制生长的方式： 降低温度 降低环境中的氧含量 使用生长延

2、缓剂 其它方法 离体种质保存的优点 占用空间少，节省人力 、物力和土地； 便于种质资源的交流利用； 需要时，可以利用离体培养方法很快大量 繁殖； 避免自然灾害引起的种质丢失。 二、超低温冰冻保存技术 （一）原理 原理：液氮中几乎所有的细胞代谢活动、 生长都停止了，因而排除了遗传性状变异 的可能性，达到长期保存植物种质的目的 。 在超低温储藏中，植物材料不仅能长期保 持形态发育的潜能，还能保持遗传性状的 稳定，是迄今唯一不需要继代的、可靠的 长期保存方法。 （二）关键问题及解决措施 关键问题：在超低温条件下，冰冻过程中避免细 胞内水分结冰，解冻过程中防止细胞内水分次生 结冰。 解决措施： 选取细

3、胞内自由水少、抗冻力强的植物材料； 采取预处理措施，提高植物的抗冻力； 在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成； （三）基本程序 1、材料的选择： 组织、细胞特征：细胞分裂旺盛、体积小、原 生质浓厚的分生细胞或组织； 培养时期：旺盛的对数生长期（抗冻力和存活 率高） 大小：适宜 （三）基本程序 2、材料的预处理 处理目的：减少细胞内自由水的含量，使细胞 经受低温锻炼，以提高组织或细胞的抗冻能力 。 处理方法： 低温锻炼 预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如DMSO 、蔗糖） （三）基本程序 冰冻保护剂0预处理 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓 度下对细胞无毒害；化冻后容易从组织细 胞中清除

4、。 常用的冰冻保护剂：DMSO、甘油、糖、 PEG等。 （三）基本程序 3、降温冰冻操作 1）直接快速冷冻 2）分级冰冻法 3）玻璃化法 4）干燥冷冻法 5）包埋冻存法 快冻法 0（或其它预处理温度）直接进入液氮。 降温速度：每分钟1000 以上。 适用对象： 高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、 块根等。 抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木 本植物的枝条或芽。 分级冷冻法 适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大 量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞 等） 程序降温仪 起始温度 0.1-10的 降温速度 -70 -40液氮 两步冷冻法 转移温度 分级冰冻法 逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在0 预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如 -10 、-15 、-23 、-40 等，一般每 级约停留5min，然后学好入液氮。 玻璃化法 玻璃化：液体转变为非晶体（玻璃态）的固化 过程。 原理：将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固 ，形成无规则的玻璃化液，将玻璃化液和材料 一起处理一段时间后投入液氮中，此时冰冻保 护液和材料一起进入玻璃化状态（冰冻过程中 水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生 结构和体积的改变。 玻璃化法 优势：设备简单、操作方便、冻存效果好。 影响因素： 玻璃化冰冻保护液的组成及浓度； 植物材料的脱水温度和脱水时间。 4、化冻操作 快速化冻