提质粒原理五之欧阳歌谷创作

1、提质粒原理五欧阳歌谷()碱裂解法抽提质粒原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是从事分子生物学研究的实验室每 天都要用的常规技术。为了方便理解这里罗列一下碱法质粒抽提 用到三种溶液：溶液 150 mM 葡萄糖 /25 mM TrisCi / 10 mM EDTAH &0;溶液 II0.2 N NaOH / 1%SDS;溶液III3M醋酸钾/ 2 M醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应首先要控制好 溶液的H因此用适当浓度的和适当H值的TrisCi溶液是再自然不 过的了。那么50mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议加 了匍萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会中夬速沉积到管 子的底部。因

2、此如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身 而言几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子 的螯合剂配在分子生物学试剂中的主要作用杲：抑制DNase的 活性和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA无 非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果 不加EDTA其实也没什么大不了的只要不磨洋工只要是在不太长 的时间里完成质粒抽提就不用怕DNA会迅速被降解因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTAO如果珈天你手上正好缺了溶液I 可不可以抽提质粒呢？实话告诉你只要用等体积的水或LB培养 基来悬浮菌体就可

3、以了。有一点不能忘的是菌体一定要悬浮均匀 不能有结块。轮到溶液II 了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体 积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH无非是 为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不 知道其实破细胞的主要杲碱而不是SDS所以才叫碱法抽提。事 实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂不管是大肠杆菌还是哺乳动 物细胞碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下）自然就难

4、高效率抽提得到质粒。如果 只用SDS当然也能抽提得到少量质粒因为SDS也是碱性的只是 弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA 变性以便沉淀这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性 复性的描述所导致。有人不禁要冋既然是NaOH溶解的细胞那为 什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两 点：第一时间不能过长千万不要这时候去接因为在这样的硕性条 件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二必须温柔混合（象对待 女孩子一样）不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦后廁我再详细说明。欧阳歌谷创编每个人都知道溶液01加入后就会有大量的沉淀但大部分人却不明 白

5、这沉淀的本质。最容易产生的误解是当SDS碰到酸性后发生的 沉淀。如果你这样怀疑往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液 看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现显然与SDS的加入 有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢也会有少量的沉淀但 量上要少得多显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS 不是遇酸发生的沉淀那会不会杲遇盐发生的沉淀呢？在1%的 SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl你会发现SDS在高盐浓度下是 会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了 SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KC1你会发现沉淀的量要多的 多。这其实是十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfa

6、te)遇到钾离 子后变成了十二烷基硫酸钾(otassium dodecylsulfate,DS)而DS 是水不溶的因此发生了沉淀。如此看来溶液III加入后的沉淀实 际上杲钾离子置换了 SDS中的纳离子形成了不溶性的DS而高浓 度的盐使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合平 均两个氨基酸上结合一个SDS分子钾钠离子置换所产生的大量沉 淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了让人高兴的杲大肠杆菌的基因 组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象因为基因组DNA 太长了长长的DNA自然容易被DS给共沉淀了尽管SDS并不与 DNA分子结合。那么2M的醋酸又杲为什么而加的呢？ 是为了中和NaOH因为

7、长时间的碱性条件会打断DNA所以要中和之。基因组DNA 旦 发生断裂只要是50-100 kb大小的片断就没有办法再被DS共沉 欧阳歌谷创编2021年2月1淀了。所以碱处理的时间要短而且不得激烈振荡不然最后得到的 质粒上总会有大量的基因组DNA混入琼脂糖电泳可以观察到一 条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液10加入后基因组DNA无法快速复性就被沉 淀了这杲天大的误会因为变性的也好复性的也好DNA分子在中 性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的DNA分 子的变性其实是个副产物与它是不杲沉淀下来其实没有关系。溶 III加入并混合均匀后在冰上放置目的是为了 DS沉淀更充分一 点。不要

8、以为DS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了其实 还有很多蛋白质不能被沉淀因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提然 后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA不然时间一长就 会因为混入的DNase而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的这里做个全的 介绍。酚（henol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉但是水饱 和酚的比重略比水重碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氟酸 M）离心后酚相会跑到上层不利于含质粒的水相的回收；但加 入氯仿后可以增加比重使得酚/氯仿始终在下层方便水相的回收； 还有一点酚与水有很大的互溶性如果单独用酚抽提后会有大量 的酚溶

9、解到水相中而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反 应）应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的 酚去除而用酚/氯仿的混合液进行抽提跑到水相中的酚则少得多微量的酚在乙醇沉淀时就合被除干净而不必担心酶切等反应不能 正常进行。至于异戊醇的添加其作用主要是为了让离心后上下 层的界更加清晰也方便了水相的回收。回收后的水相含有足够多的盐因此只要加入2倍体积的乙醇在 室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如 果放到20C时间一长反而会导致大量盐的沉淀这点不同于普通的 DNA酒精沉淀回收所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量 的水分子因DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果

10、沉 淀就用70%的乙醇多洗几次每次在室温放置一个小时以上并用ti 将沉淀打碎就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase(50ug/ml)的TE缓冲液进行溶解不然大量未降解的RNA会干 扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时多数情况下你 能看到三条带但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这 三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA不信的话你用 EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳就会看到线性质粒DNA 的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快 慢而排序分别是超螺旋、幵环和复制中间体(即没有复制完全的 两个质粒连在了一起)。如果你不小心在溶液II加入后过度

11、振荡 合有第四条带这条带泳动得较慢远离这三条带杲20100kb的大肠 杆菌基因组DNA的片断。补充1. A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长最佳测量值的范围为0.1至1.0o如 欧阳歌谷创编2021年2月1果不在此范围稀释或浓缩样品使之在此范围内；如果吸光度小于0.05检查是否存在操作因素（如移液不准确样品内有悬浮物等） 影响。DNA样品的A260吸光度值杲否>0.1o （请注意这个值 跟仪器无关核酸的吸光度必需大于0.1其值才有效和可靠因为样 品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收其值朗伯-比尔定律：A吸光值10入射光强度I投射光强度c吸光物质的摩尔浓度（mol/L）d

12、光通过的液层厚度（cm）摩尔吸光系数（Lmollcml）2. A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长比值可进行核酸样品纯 度评估:纯DNA的A260/A280比值为1.8纯RNA为2.0。如果 比值低表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染需要纯化样 品。比值=15相当于50%蛋白质/DNA溶液3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长比值可逬行核酸样品纯度评佶:纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染需要纯化欧阳歌谷创编2021年2月1样品。A230产生负值主要是由于在很低DNA浓度的溶液中的一 些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中需要降低样品的稀 释度A230的负值会被校正。4. A320nm 或 A340nm为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果 不是标明溶液中有悬浮物需要纯化样品。纯样品的A320 般是 0o5. A260/A280 和 A260/A230是核酸纯度的指示值纯度好的DNA在H78.5下其比值应该在2.0 或2.