分子生物学实验技术(聚合酶链式反应)

1、第三节第三节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 Polymerase chain reactionPolymerase chain reaction PCRPCR Content of Table 定义定义 技术优点技术优点 原理原理 标准反应体系标准反应体系 反应五要素反应五要素 热循环条件的选择热循环条件的选择 反应特点反应特点 常见问题与对策常见问题与对策 污染污染 10 10 应用应用 1 1 定义定义 在引物指导下由酶催化的在引物指导下由酶催化的 对特定克隆或基因组对特定克隆或基因组DNADNA序列序列 进行的体外扩增反应。进行的体外扩增反应。 HomeHome 2 2 技术优点技术优点

2、 特异、敏感、产率高、快速、简便、重复特异、敏感、产率高、快速、简便、重复 性好、易自动化等性好、易自动化等 HomeHome 3 3 原理原理 Region to be copied denaturatation Primer annealing Primer extension Cycle 2 Cycle 3 PCRPCR技术原理技术原理 类似于类似于DNADNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列 两端互补的寡核苷酸引物。两端互补的寡核苷酸引物。 模板模板DNADNA变性：变性：加热至加热至9494左右，双链左右，双链DNADNA解离成单链；解离成

3、单链； 模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火( (复性复性) )：5555左右，引物与模板左右，引物与模板 DNADNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：引物的延伸：在在TaqTaq DNA DNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTPdNTP为原料，为原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成 一条新的双链；一条新的双链； 重复循环重复循环变性变性-退火退火-延伸延伸三过程，使三过程，使DNADNA扩增量呈指扩增量呈指 数上升。数上升。 PCR productPCR product PCR反应曲线

4、反应曲线 HomeHome 4 4 标准反应体系标准反应体系 10扩增缓冲液扩增缓冲液 10l 4种种dNTP混合物混合物 各各200mol/L 引物引物 10100 pmol 模板模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5 u （Mg2+） 1.5 mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul HomeHome 5 5 反应五要素反应五要素 引物引物 （primerprimer） 酶酶 （TaqTaq DNA polymerase DNA polymerase） dNTP dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTPdATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模

5、板模板 （templatetemplate） MgMg2+ 2+ （ （magnesiummagnesium） 5.1 引物引物 引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键特异性反应的关键 PCR PCR 产物的特异性取决于引物与产物的特异性取决于引物与 模板模板DNADNA互补的程度互补的程度 引物设计的原则引物设计的原则 引物长度：引物长度：15-3015-30个碱基，常为个碱基，常为2020个个 碱基左右碱基左右 引物扩增跨度：引物扩增跨度：以以500 bp500 bp为宜，特定为宜，特定 条件下可扩增长至条件下可扩增长至10kb10kb的片段的片段 引物碱基：引物碱基：G+CG+C含量以

6、含量以40-60%40-60%为宜为宜, , ATGCATGC最好随机分布最好随机分布 避免引物内或引物间出现二级结构避免引物内或引物间出现二级结构 避免两引物间互补，特别是避免两引物间互补，特别是 33端端 引物引物 33端的碱基要求严格配对端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基特别是最末及倒数第二个碱基 引物中可以加上合适的酶切位点引物中可以加上合适的酶切位点 要作酶切时加要作酶切时加 引物的特异性引物的特异性 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性源性 两引物的两引物的TmTm值接近值接近 5.2 酶及其浓度酶及其浓度 TaqTa

7、q DNA DNA聚合酶聚合酶 注：注：无无33 5 5方向的校正活性方向的校正活性 DNADNA复制复制1/101/109 9；PCR PCR 出错率出错率1/(21/(210104 4) 一个典型的一个典型的 PCR PCR 反应约需酶量反应约需酶量 2.5 U2.5 U 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度浓度过高可引起非特异性扩增，浓度 过低则合成产物量减少过低则合成产物量减少 5.3 dNTP 的质量与浓度的质量与浓度 dNTP dNTP使用注意：使用注意： 1)1)保存：保存：使用时应配成高浓度，使用时应配成高浓度，小量分装小量分装，- - 2020冰冻保存。多次冻融会使冰冻保存。多次

8、冻融会使dNTPdNTP降解；降解； 2)2)使用量：使用量：在在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为20-200umol/L20-200umol/L。 3)3)成分配比：成分配比：注意注意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等；的浓度要相等； 5.4 5.4 模板（模板（templatetemplate） 模板核酸的量与纯化程度，模板核酸的量与纯化程度， 是是PCRPCR成败的关键环节之一。成败的关键环节之一。 5.5 Mg5.5 Mg2+ 2+浓度 浓度 1)Mg1)Mg2+ 2+对扩增特异性和产量有显著影响 对扩增特异性和产量有显著影响: : MgMg2+ 2+浓度过高，

9、反应特异性降低；浓度过低会 浓度过高，反应特异性降低；浓度过低会 降低降低 Taq DNADNA聚合酶活性，使反应产物减少聚合酶活性，使反应产物减少。 2)2)在一般的在一般的PCRPCR反应中，各种反应中，各种dNTPdNTP浓度为浓度为 200mol/L200mol/L时，时，MgMg2+ 2+浓度为 浓度为1.51.52.0 2.0 mmolmmol/L/L为宜；为宜； HomeHome 6 6 热循环条件的选择热循环条件的选择 PCR反应条件反应条件: 温度温度 时间时间 循环次数循环次数 6.1 温度与时间的设置温度与时间的设置 设置变性设置变性- -退火退火- -延伸三个温度点：延

10、伸三个温度点： 标准反应中采用标准反应中采用三温度点法：三温度点法： 1 1）93-9593-95变性变性； 2 2）40-6040-60退火退火； 3 3）70-7570-75延伸延伸 对于较短靶基因（长度为对于较短靶基因（长度为100100300bp300bp时）时） 可采用二温度点法，可采用二温度点法， 一般采用一般采用9494变性，变性， 6565左右退火与延伸左右退火与延伸 变性温度与时间：变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCRPCR失败失败 的最主要原因的最主要原因 一般一般93939494 l min l min足以使模板足以使模板DNA

11、DNA变性变性 若低于若低于9393则需延长时间则需延长时间 但温度不能过高，高温环境对酶的活但温度不能过高，高温环境对酶的活 性有影响。性有影响。 退火退火( (复性复性) )温度与时间：温度与时间： 退火温度是影响退火温度是影响PCRPCR特异性的较重要因素特异性的较重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成 及其浓度，还有模板的长度及其浓度，还有模板的长度 复性温度复性温度 当引物长度为当引物长度为15-2015-20个碱基时，在高离子个碱基时，在高离子 强度中反应（如强度中反应（如1M NaCl1M NaCl） Tm = 4Tm =

12、4（G+CG+C）2 2（A+TA+T） 复性温度复性温度=Tm=Tm值值 - -（5 51010） 复性时间复性时间 一般一般3060 sec，足以使引物与模板间完全结合，足以使引物与模板间完全结合 延伸温度与时间：延伸温度与时间： 温度：温度： 一般一般70707575，常用温度为常用温度为7272。 时间：时间： 根据待扩增片段长度而定根据待扩增片段长度而定, ,1Kb1Kb以内的以内的 DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min。 6.2 循环次数循环次数 决定决定PCRPCR扩增程度扩增程度 主要取决于模板主要取决于模板DNADNA的浓度的浓度 选在选在25254040

13、次之间次之间 HomeHome 7 7 反应特点反应特点 7.1 特异性强特异性强 靶序列的特异性决定扩增产物的特异性。靶序列的特异性决定扩增产物的特异性。 在较高的温度下进行，引物结合的特异性在较高的温度下进行，引物结合的特异性 大大增加。大大增加。 7.2 灵敏度灵敏度高高 PCR PCR 产物的生成量是以指数方式增加产物的生成量是以指数方式增加 从从 100 100 万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞 在细菌学中最小检出率为在细菌学中最小检出率为3 3个细菌个细菌 7.3 简便、快速简便、快速 在在DNADNA扩增仪中进行扩增仪中进行变性变性- -退火退火- -延伸延伸 反

14、应，一般反应，一般1 13 3 小时完成。小时完成。 7.4 对模板的纯度要求低对模板的纯度要求低 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗可直接用临床标本如血液、体腔液、洗 嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNADNA 或或RNARNA扩增检测。扩增检测。 HomeHome 无扩增产物 1.1.模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低 2.2.BufferBuffer对样品不合适对样品不合适 3.3.引物设计不当或者发生降解引物设计不当或者发生降解 4.4.退火温度太高，延伸时间太短退火温度太高，延伸时间太短 现象现象：正对照有条带，正对照有条带， 而样品

15、则无而样品则无 原原 因因 非特异性扩增 现象：现象： 1 1）PCRPCR扩增后出现的条带与预计的扩增后出现的条带与预计的 大小不一致；大小不一致； 2 2）或者同时出现特异性扩增带与非或者同时出现特异性扩增带与非 特异性扩增带。特异性扩增带。 1) 1) 引物特异性差引物特异性差, , 2) 2) 模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高 3) 3) 酶量过多酶量过多 4) Mg4) Mg2+ 2+浓度偏高 浓度偏高 5) 5) 退火温度偏低退火温度偏低 6) 6) 循环次数过多循环次数过多 原原 因因 非特异性扩增 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态 M 1 2

16、 1) 1) 模板不纯或降解模板不纯或降解 2) Buffer2) Buffer不合适不合适 3) 3) 退火温度偏低退火温度偏低 4) 4) 酶量过多酶量过多 5) dNTP5) dNTP、MgMg2+ 2+浓度偏高 浓度偏高 6) 6) 循环次数过多循环次数过多 原原 因因 拖尾 假阳性假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况筛选转基因、检测基因表达情况) ) 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 1) 1) 操作时防止将操作时防止将靶序列靶序列吸入加样枪内或溅出吸入加样枪内或溅出 离心管外；离心管外； 2) 2)

17、除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均 高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。 3) 3) 各种试剂先进行分装，低温贮存。各种试剂先进行分装，低温贮存。 对对 策策 假阳性 HomeHome 9 PCR污染污染 9.1 污染原因污染原因 (1) 模板间交叉污染模板间交叉污染 (2) PCR试剂污染试剂污染 (3) 实验室中克隆质粒的污染实验室中克隆质粒的污染 9.2 防止污染的方法防止污染的方法 (1) (1) 合理分隔实验室合理分隔实验室 (2) (2) 移液枪不能接触移液枪不能接触PCRPCR相关试剂相关试剂 (3) (3

18、) 手套、吸头、小离心管一次性使用手套、吸头、小离心管一次性使用 (4) (4) 设阳性和阴性对照，设阳性和阴性对照，重复实验重复实验 HomeHome 10 PCR10 PCR技术的应用技术的应用 (1) (1) 基因组中特异片段克隆基因组中特异片段克隆 (2) (2) 不对称不对称PCRPCR (3) (3) 反向反向PCRPCR (4) (4) 基因的体外诱变基因的体外诱变 (5) (5) RT-PCRRT-PCR (6) (6) 基因组的比较研究基因组的比较研究 HomeHome 基基 因因 组组 中中 特特 异异 片片 段段 的的 扩扩 增增 5 3 3 5 5 3 5 3 3 5

19、3 5 53 53 5 3 3 5 5353 引物序列特征引物序列特征 引物设计引物设计 5 3 3 5 5 3 3 5 35 3 5 5 5 5 3 3 5 5 5 基基 因因 组组 中中 特特 异异 片片 段段 的的 扩扩 增增 3 3 3 3 模板变性，引物退火模板变性，引物退火 引物延伸引物延伸 循环变性、退火、延伸循环变性、退火、延伸 5 3 3 5 5 3 3 5 3 3 5 3 5 3 5 5 5 5 5 5 3 3 不不 对对 称称 P C R 双引物退火双引物退火 双引物扩增双引物扩增 单引物扩增单引物扩增 产生大量的单链产生大量的单链DNA片段片段 5 3 3 5 5 3

20、3 5 5 3 3 5 反向反向 PCR 正确正确 流程流程 环化环化 引物设计引物设计 5 3 3 5 5 5 3 3 5 第一个循环模板变性、引物第一个循环模板变性、引物 退火和延伸退火和延伸 多次循环：模板变性、引物多次循环：模板变性、引物 退火和延伸，得大量退火和延伸，得大量PCR产产 物物 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 反向反向 PCR 错误错误 流程流程 一一 环化环化 引物设计引物设计 PCR扩增扩增 5 3 3 5 5 3 3 5 5353 反向反向 PCR 错误错误 流程流程 二二 引物设计引物设计 PCR扩增扩增 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 反向反向 PCR 错误错误 流程流程 三三 引物设计引物设计 PCR扩增扩增 A T A T A T G C 5 3 3 5 5 3 5 3 3 5 3 5 53 35 基基 因因 的的 体体 外外 突突 变变 管管1 管管2 引物设计引物设计 管管1引物设计引物设计 管管2引物设计引物设计 A T G C 5 3 3 5 53 35 A T