生物化学课件：第28章 基因诊断与基因治疗

1、目目 录录 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy 第二十八章第二十八章 目目 录录目目 录录 F第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础 F第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断 F第三节第三节 传染病的基因诊断传染病的基因诊断 F第四节第四节 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断 F第五节第五节 基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用 F第六节第六节 基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 本章内容提要本章内容提要 目目 录录目目 录录 第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础 Basis of Gene Dia

2、gnostics 目目 录录目目 录录 基因诊断之父基因诊断之父简悦威简悦威 1976年加州大学华裔科学家年加州大学华裔科学家 Kan YW 用核酸分子杂交技术首次对一例用核酸分子杂交技术首次对一例地中海贫地中海贫 血进行诊断。血进行诊断。 目目 录录 目目 录录 一、一、基因诊断的概念、特点及临床意义基因诊断的概念、特点及临床意义 定义：定义： 利用分子生物学技术，通过检测基因及基利用分子生物学技术，通过检测基因及基 因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断 的方法。基因诊断检测的目标分子是的方法。基因诊断检测的目标分子是DNADNA、 RNARNA，

3、也可以是蛋白质或者多肽。，也可以是蛋白质或者多肽。 目目 录录目目 录录 诊断依据诊断依据(遗传物质改变遗传物质改变) lDNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及或蛋白质水平变化，如病毒基因及 其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平 从低到高；从低到高； l基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色 体转位引起基因异常激活或灭活。体转位引起基因异常激活或灭活。 目目 录录目目 录录 基因诊断的特点基因诊断的特点 高特异性高特异性 高灵敏性高灵敏性 早期诊断性早期诊断性 应用广泛性应用广泛性 目目 录录 目目 录

4、录 二、基因诊断中常用的分子生物学技术二、基因诊断中常用的分子生物学技术 n核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） n聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR) n单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP） n限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP） nDNA序列测定（序列测定（DNA sequencing） n生物芯片（生物芯片（biochips） nWestern免疫印迹（免疫印迹（Western blotting） n免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 目目 录录 目目 录录 （一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交 Nucleic aci

5、d hybridization 指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离 子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重 新配对形成双链的过程。新配对形成双链的过程。 目目 录录 目目 录录 核酸分子杂交流程核酸分子杂交流程 待测核酸制备待测核酸制备 滤膜上核酸固化滤膜上核酸固化 杂交杂交 去除未杂交的探针去除未杂交的探针 检测杂交信号检测杂交信号 核酸探针制备核酸探针制备 探针标记探针标记 加入标记探针加入标记探针 目目 录录 目目 录录 提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化DNA以产以产 生特定长度的片段生特定长度

6、的片段凝胶电泳分离凝胶电泳分离 变性处变性处 理理DNA转印到膜上并使其牢固结合转印到膜上并使其牢固结合将标将标 记的探针与膜上记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信片段杂交，分析杂交信 号。号。 1. Southern 印迹杂交印迹杂交(Southern blotting) 目目 录录 目目 录录 RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移 到固相支持物上，通过分子杂交检测特定到固相支持物上，通过分子杂交检测特定 的的mRNA分子的含量与大小。分子的含量与大小。 2. Northern印迹杂交印迹杂交(Northern blotting) 目目 录录 目目 录录 3.

7、斑点杂交（斑点杂交（dot blotting） 将将RNA或或DNA变性后直接点样于硝酸纤变性后直接点样于硝酸纤 维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因 及其表达产物的定性及定量的研究。及其表达产物的定性及定量的研究。 目目 录录 目目 录录 4. 反向斑点杂交反向斑点杂交 （reverse dot blotting） 先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙 膜上，将样品膜上，将样品RNA或或DNA标记变性后进行标记变性后进行 杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只 能检测一种样品的局限，大大提高

8、了基因能检测一种样品的局限，大大提高了基因 诊断的效率诊断的效率。 目目 录录 目目 录录 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分 子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变 ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大 大提高检测结果的可靠性。大提高检测结果的可靠性。 等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO） 目目 录录 目目 录录 5. 5. 原位分子杂交原位分子杂交 n荧光原位杂交荧光原位杂交 (flu

9、orescence in situ hybridization, FISH） n挂锁挂锁FISH (FISH with padlock) 目目 录录目目 录录 荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH） 目目 录录 目目 录录 6. 固相夹心杂交法固相夹心杂交法 (sandwich hybridization) 待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的DNA 片段（片段（A、B片段），分别作为捕捉探针（不标记片段），分别作为捕捉探针（不标记 的的A片段）和检测探针（标记的片段）和检测探针（标记的B片段），同时与片段），同时与 靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支

10、持物上，靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上， 与靶基因序列与靶基因序列A部分杂交，再加入标记的检测探针，部分杂交，再加入标记的检测探针， 检测探针与靶基因序列检测探针与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号。部分杂交，检测杂交信号。 目目 录录 目目 录录 固相夹心杂交法示意图固相夹心杂交法示意图 目目 录录目目 录录 （二）（二） 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR） 模板模板 引物引物 dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶聚合酶 变性变性 延伸延伸退火退火 目目 录录 目目 录录 PCR在基因诊断中的应用在基因诊断中的应用

11、nRT-PCRRT-PCR n荧光定量荧光定量PCRPCR n多重多重-PCR-PCR nPCR-ASOPCR-ASO nAS-PCRAS-PCR nPCR-SSCPPCR-SSCP nPCR-RFLPPCR-RFLP 目目 录录 目目 录录 1. RT-PCR 目目 录录目目 录录 2. 荧光定量荧光定量PCR 荧光标记引物荧光标记引物 目目 录录 目目 录录 3. 多重多重PCR 多重多重PCRPCR示意图示意图 A A：普通：普通PCRPCR；B B：多重：多重PCRPCR 目目 录录 目目 录录 4. PCR-ASO N N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基因；M

12、M：突变基因：突变基因 ASO1ASO2 N H M 目目 录录 目目 录录 （三）（三）单链构象多态性分析单链构象多态性分析 （single-strand conformation polymorphism, SSCP） DNA 的突变造成的突变造成DNA片段中碱基序列不片段中碱基序列不 同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的 构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的 差别可使各种序列不同的单链分离开来。差别可使各种序列不同的单链分离开来。 目目 录录目目 录录 PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意 目目

13、录录目目 录录 正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变 + + PCR-SSCP分析分析 目目 录录 目目 录录 （四）限制性片段长度多态性分析（四）限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism, RFLP） 由于由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切变异产生新的酶切位点或原有的酶切 位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同 长度或不同数量的片段。长度或不同数量的片段。 可借助核酸分子杂交或可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。进行检测。 目目 录录 目目 录录 设计适当的

14、扩增引物，使扩增片段包括某设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某 一个或数个限制性内切酶识别序列，在一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩扩 增后用该限制酶切割增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶产物，根据电泳后酶 切片段长度变化，即可作出诊断。切片段长度变化，即可作出诊断。 PCR-RFLP 目目 录录 目目 录录 ABCDEFG D E F B G C A GAATTC CTTAAG E F B G C +D A EcoR 限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化 目目 录录 目目 录录 （五）（五） DNA序列测定（序列测定（DNA sequencing） 目目 录录 目目

15、录录 DNA序列测定原理序列测定原理(双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法) 目目 录录目目 录录 左侧：正常；右侧突变左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究序列分析用于基因诊断研究 目目 录录 目目 录录 （六）生物芯片（六）生物芯片（biochips） n基因芯片（基因芯片（gene chips） n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip) 目目 录录 目目 录录 基因芯片杂交流程示意图基因芯片杂交流程示意图 目目 录录 目目 录录 基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较 方法方法优点与问题优点与问题解决方案解决方案 核酸分子杂交核酸分子杂交结果可

16、靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择合适的探针选择合适的探针 PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高设计合适的引物设计合适的引物 SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择合适的片段选择合适的片段 RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多选择合适的限制酶选择合适的限制酶 DNADNA测序测序可自动化，但不适宜广泛使用可自动化，但不适宜广泛使用与与PCRPCR配合使用配合使用 生物芯片生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛效率高，成本高，不适宜广泛 使用使用 选择合适的芯片选择合适的芯片 目目 录录 目目 录录 三、三、 基因诊断技术路线与方法基因诊断技术路线与方法

17、 n直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表 达是否异常达是否异常 n间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因 进行连锁分析进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决根据对致病基因或相关基因的了解程度决 定基因诊断的技术途径选择。定基因诊断的技术途径选择。 目目 录录 目目 录录 （一）直接诊断途径（一）直接诊断途径 必要条件：必要条件： 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化

18、）被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化） 已知已知 目目 录录 目目 录录 5/ 5/ 3/ 3/ RFLP 1. 1.点突变的检测点突变的检测 （1 1）有限制性内切酶位点改变）有限制性内切酶位点改变 目目 录录目目 录录 斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交 AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、 PCR产物直接测序产物直接测序 5/ 5/ 3/ 3/ （2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 目目 录录目目 录录 在在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。序列上有一段较长序列的重新排布。 包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替包括数十个碱基到数千

19、个碱基的丢失、插入、替 换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包 括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合 征）等。征）等。 2. 2. 基因重排的检测基因重排的检测 核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR 目目 录录目目 录录 BamHI BamHI 2 2 1 1 2 2 10 kb 14 kb probe - -珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断 - -珠蛋白珠蛋白基因不同程度的缺失可引起基因不同程度的缺失可引起 不同类型的不同类型的 - -珠蛋白生成障碍性贫血珠

20、蛋白生成障碍性贫血 目目 录录 目目 录录 根据引物根据引物3 3 端的互补与否，设计一对与正端的互补与否，设计一对与正 常或突变模板配对的特异引物常或突变模板配对的特异引物 等位基因特异等位基因特异PCR AS-PCR（allele specific PCR） 目目 录录目目 录录 3. 基因表达异常的检测基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析 mRNA长度分析长度分析 目目 录录 目目 录录 （二）间接诊断途径（二）间接诊断途径 1.1.采用原因采用原因 致病基因未知或基因结构不确定致病基因未知或基因结构不确定 致病突变机制不清致病突

21、变机制不清 致病位点不便检测致病位点不便检测 目目 录录目目 录录 DNA多态性：多态性：指群体中的指群体中的DNA分子存分子存 在至少两种不同的类型，即个体间同一染色在至少两种不同的类型，即个体间同一染色 体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异 或变异。或变异。 多在进化中形成，本身并不致病，只是多在进化中形成，本身并不致病，只是 与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。 2. 2. 遗传标记遗传标记 目目 录录目目 录录 间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记 三代遗传标记：三代遗传

22、标记： RFLP（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术） VNTR (variable number of tandem repeats) ; STR (short tandem repeats) SNP(single nucleotide polymorphism) 目目 录录目目 录录 7.6kb 13kb 患患 者者 正正 常常 HBS的间接基因诊断的间接基因诊断 RFLP标记的连锁分析标记的连锁分析 Hap 7.6kb 13kb SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交 N H P N N：正常；：正常；H H：杂合子；：杂合子；P P：患者（纯合子）；黄色区域为探针：

23、患者（纯合子）；黄色区域为探针 目目 录录 目目 录录 第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断 Gene Diagnosis of Hereditary Diseases 目目 录录 目目 录录 一、血红蛋白病（一、血红蛋白病（hemoglobinopathy） （一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病 （二）（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症 二、血友病（二、血友病（Hemophilia） 甲型血友病基因诊断甲型血友病基因诊断 三、脆性三、脆性X综合征综合征 目目 录录 目目 录录 （一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病 一、血红蛋白病一、血红蛋白病 1.镰状红细

24、胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法 2.HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析 3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 目目 录录 目目 录录 n正常的（正常的（N）的）的ASO探针：探针： 5 -ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 n突变的（突变的（M）的）的ASO探针：探针： 5 -ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3 1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断 ASO杂交法杂交法 目目 录录 目目 录录 斑点杂交结果斑点杂交结果 N N：正常；：正常；M M突变突变 镰状红细胞贫血患者镰状红细胞

25、贫血患者ASO杂交法检测杂交法检测 N-ASO M-ASO 正常正常 突变突变 突变突变 纯合子纯合子 杂合子杂合子 纯合子纯合子 5 3 正常基因正常基因 1.15kb (CCT GAG G) 5 3 突变基因突变基因 1.35kb (CCT GTG G) 镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析 Mst酶切位点酶切位点（CCTNAGG） 2. HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析 目目 录录 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人正常人突变携带者突变携带者 患者患者 镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析 目目

26、 录录 目目 录录目目 录录 3. HBS的的PCR-RFLP分析分析 正常人的扩增产物经正常人的扩增产物经 MstMst 消化可生成消化可生成54bp54bp和和56bp56bp两个片段，而镰状细两个片段，而镰状细 胞贫血症患者的胞贫血症患者的DNADNA片段不被酶切，仍为片段不被酶切，仍为110bp110bp，杂合子可见三条带，杂合子可见三条带 正常人正常人杂合体杂合体患者患者 Marker 目目 录录 目目 录录 1. PCR-RFLP分析分析 -珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测突变的检测 M：pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片

27、段；未酶解片段； 2：bA/ bA； 3：bA/ bT； 4：bT/ bT 注：由于注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量标准中低于片段及分子量标准中低于200 bp的片段太小，在的片段太小，在0.8的琼脂糖凝胶中不易被观察到的琼脂糖凝胶中不易被观察到 （二）（二） - -珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症 目目 录录目目 录录 -珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析 2. 2. 反向斑点杂交反向斑点杂交 目目 录录 目目 录录 二、血友病（二、血友病（Hemophilia） n甲型血友病是由于血浆凝血因子甲型血友病是由于血

28、浆凝血因子VIII （FVIII）缺陷造成。）缺陷造成。 n甲型血友病的基因突变类型已有甲型血友病的基因突变类型已有300余种，余种， 其中点突变占其中点突变占174种；另有部分患者是由于种；另有部分患者是由于 缺失或插入突变或内含子缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。的基因倒位所致。 目目 录录 目目 录录 1. FVIII基因倒位的基因倒位的DNA印迹分析印迹分析 将基因组将基因组DNA用用Nco I，Dra I或或Bcl I等内切酶等内切酶 （酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行 杂交分析，正常人表现为杂交分析，正常人表现为21

29、.5 kb、14 kb和和16 kb三种三种 类型。类型。I型倒位患者表现为型倒位患者表现为20、17.5和和14 kb三种类型；三种类型； 型倒位患者表现为型倒位患者表现为20、16和和15.5 kb三种带型。在三种带型。在 一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。 目目 录录 目目 录录 2. FVIII基因突变的检测基因突变的检测 （1）依赖于）依赖于FVIII基因内或旁侧的多态性标记基因内或旁侧的多态性标记 的连锁分析的连锁分析 （2）RFLP连锁分析连锁分析 （3）VNTR分析分析 （4）短串联重复序列（）短串联重复序列（STR）的

30、连锁分析）的连锁分析 目目 录录 目目 录录 三、脆性三、脆性X综合征综合征 n脆性脆性 X 智力低下基因智力低下基因1（FMR1）5非翻译区遗传不稳非翻译区遗传不稳 定的定的(CGG)n 三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻 CpG 岛的异常甲基化。岛的异常甲基化。 n正常人中约为正常人中约为 850 拷贝。拷贝。 n男性和女性携带者增多到男性和女性携带者增多到52200拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG 岛岛 未被甲基化，称为前突变（未被甲基化，称为前突变（premutation）。）。 n男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到男性患者和脆性部位高表达的女性中，

31、达到2001000 拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG岛也被甲基化，称为全突变（岛也被甲基化，称为全突变（full mutation）。）。 n全突变可关闭相邻全突变可关闭相邻FMR1基因的表达，基因的表达，FMR1 mRNA在在 几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。 目目 录录 目目 录录 脆性脆性X综合征常用基因诊断方法综合征常用基因诊断方法 1PCR-ASO 2DNA连锁分析连锁分析 3Souhern印迹杂交法印迹杂交法 4PCR扩增扩增 第三节第三节 传染病的基因诊断传染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Inf

32、ectious Diseases 目目 录录 一、病毒性疾病一、病毒性疾病 n甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAV） HAV系系RNA病毒，利用病毒，利用RT-PCR技术可从粪便技术可从粪便 中检测出甲型肝炎病毒的基因组中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。 n乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV） 设计保守区序列引物，扩增各型设计保守区序列引物，扩增各型HBV DNA片片 段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBV DNA，以便分型。，以便分型。 n丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCV） HCV为正链为正链RNA病毒，先反转录成病毒，先反转录成cDNA，再，再 进

33、行巢式进行巢式PCR检测检测HCV。 目目 录录 目目 录录 目目 录录 二、细菌引起的疾病二、细菌引起的疾病 n结核分枝杆菌结核分枝杆菌 先设计一对特异性引物，用先设计一对特异性引物，用PCR 技术扩增出一技术扩增出一383 bp序列，再用探针序列，再用探针 杂交，灵敏度可达到杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。个细菌水平。 n幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（HP） 主要采用主要采用PCR技术：检测技术：检测HP染染 色体色体DNA特异片段；检测特异片段；检测HP尿素酶尿素酶 A基因；用基因；用PCR-RFLP鉴别鉴别HP菌株。菌株。 目目 录录 目目 录录 三、寄生虫及衣原体感染三、寄生虫及衣原体

34、感染 n疟原虫疟原虫 n卡氏肺孢子虫卡氏肺孢子虫 n衣原体感染衣原体感染 诊断方法：核酸杂交和诊断方法：核酸杂交和PCR技术技术 目目 录录 目目 录录 第四节第四节 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断 Gene Diagnosis of Malignant Tumors 目目 录录 目目 录录 一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌乳腺癌 结肠癌结肠癌 目目 录录 目目 录录 一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测 1原癌基因的检测原癌基因的检测 ras 基因家族由基因家族由H-ras、K-ras和和N-ra

35、s组成。最常见组成。最常见 的突变是第的突变是第12、13、59或第或第61位密码子的点突变。位密码子的点突变。 胰腺癌、结肠癌、肺癌以胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-ras突变为主，如第突变为主，如第12 位密码子突变，由编码甘氨酸的位密码子突变，由编码甘氨酸的GGT突变为突变为TGT、 GTT或或GAT，少数突变为，少数突变为GCT。 急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以 N-ras突变为主；泌尿系统肿瘤则以突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。突变为主。 目目 录录 目目 录录 PCR 及及PCR-SSCP分析：分析：扩增扩增ras 基因

36、第基因第 12位密码子点突变部位，再用位密码子点突变部位，再用SSCP技术进行分技术进行分 析，或者直接测序确定患者析，或者直接测序确定患者ras原癌基因的点突原癌基因的点突 变。变。 核苷酸杂交技术（如核苷酸杂交技术（如ASO）：）：检测检测ras基因基因 第第12位密码子点突变。位密码子点突变。 2. ras原癌基因突变常用的检测方法原癌基因突变常用的检测方法 目目 录录 目目 录录 3抑癌基因抑癌基因p53的检测的检测 np53基因以密码子第基因以密码子第175位、第位、第248位、第位、第249位、位、 第第273位及位及 第第282位点突变率最高。在结直肠癌、位点突变率最高。在结直肠

37、癌、 乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53基因基因 蛋白。蛋白。 np53的基因诊断方法有的基因诊断方法有 （1）PCR-SSCP分析技术分析技术 （2）DNA序列分析序列分析 （3）PCR-RFLP分析分析 目目 录录 目目 录录 （一）乳腺癌（一）乳腺癌 1乳腺癌常见基因变异乳腺癌常见基因变异 5%10%乳腺癌患者有家族遗传性。乳腺癌乳腺癌患者有家族遗传性。乳腺癌 高危家族中常有抑癌基因的高危家族中常有抑癌基因的BRCA基因（基因（breast cancer gene）的突变。）的突变。 BRAC1突变易致乳腺癌。突变分布于整个编突变易致乳腺癌。突变分布于

38、整个编 码序列，没有明显的突变簇或突变热点。码序列，没有明显的突变簇或突变热点。70%的缺的缺 失或插入导致编码序列的框移和翻译提前终止。失或插入导致编码序列的框移和翻译提前终止。 BRCA1在在N端的一半部位截短，与乳腺癌和卵巢癌端的一半部位截短，与乳腺癌和卵巢癌 的高风险相关；而在的高风险相关；而在C端截短则主要与乳腺癌高危端截短则主要与乳腺癌高危 有关。有关。 BRCA2基因在基因在30%40%的散发性乳腺癌有杂的散发性乳腺癌有杂 合性缺失（合性缺失（LOH）。突变提高乳腺癌易感性。）。突变提高乳腺癌易感性。 二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断 目目 录录 目目 录录 （1）P

39、CR法检测法检测BRCA1基因突变基因突变 （2）荧光原位杂交（）荧光原位杂交（FISH）检测）检测BRCA2基基 因扩增因扩增 2乳腺癌基因诊断方法乳腺癌基因诊断方法 目目 录录 目目 录录 （二）结肠癌（二）结肠癌 1.结肠癌常见基因变异结肠癌常见基因变异 在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变。在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变。 APC（adenomatous polyposis coli）是结肠癌发）是结肠癌发 生过程中第一个突变基因。生过程中第一个突变基因。K-ras原癌基因突变也是原癌基因突变也是 结肠癌形成的早期事件。结肠癌形成的早期事件。 DCC（deletion o

40、f colorectal cancer）基因失活）基因失活 是结肠癌发展的晚期事件。抑癌基因是结肠癌发展的晚期事件。抑癌基因DPC4和和 MADR2也可能会因也可能会因18q等位基因丢失而失活。等位基因丢失而失活。 p53基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象。基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象。 DNA修复基因也与结肠癌有关。如修复基因也与结肠癌有关。如hMSH2、 hMLH1、hPMS1或或hPMS2基因的突变所致的基因的突变所致的DNA错错 配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关。配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关。 二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断 目目 录录

41、目目 录录 （1）PCR-SSCP法：法：对腺瘤样息肉病人对腺瘤样息肉病人APC基基 因因PCR-SSCP技术进行分析。技术进行分析。 （2）异源双链）异源双链PCR法：法：检测检测APC基因变异。基因变异。 （3）蛋白质免疫印迹法：）蛋白质免疫印迹法：检测因基因突变而缩检测因基因突变而缩 短了的短了的APC蛋白。蛋白。 2结肠癌基因诊断方法结肠癌基因诊断方法 第五节第五节 基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用 Application of Gene Diagnosis in Forensic Medicine 目目 录录 目目 录录 目目 录录 n重复序列以各自核心序列（重复单元

42、）首尾相重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相 连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数 在人群中存在变异，形成多态性。在人群中存在变异，形成多态性。 n串联重复序列散在分布于染色体上。串联重复序列散在分布于染色体上。 n重复单位重复单位625 bp长，称为小卫星长，称为小卫星DNA。 重复单位重复单位26 bp长，如（长，如（TA）n, (CGG)n等，等， 称为微卫星称为微卫星DNA。 一、一、DNADNA指纹与多态性遗传标记指纹与多态性遗传标记 目目 录录 目目 录录 可变数目串联重复序列可变数目串联重复序列(VNTR) 人类染色体上小卫星人类染

43、色体上小卫星DNA的高度可变区的高度可变区 （HVR）是由头尾相连的串联重复序列）是由头尾相连的串联重复序列 （tandem repeat，TR）组成，）组成，TR的核心序列的核心序列 同源性很高，等位同源性很高，等位HVR的长度由于的长度由于TR的重复的重复 次数不同而有很大的差别，具高度多态性。次数不同而有很大的差别，具高度多态性。 目目 录录 目目 录录 DNA长度多态除可用长度多态除可用Southern印迹杂交法印迹杂交法 检测外，还可以通过检测外，还可以通过PCR扩增后电泳来检出。扩增后电泳来检出。 扩增片段长度多态扩增片段长度多态 （amplified fragment lengt

44、h polymorphism, Amp-FLP） 1985年，英国遗传学家年，英国遗传学家 Jeffeys等人用等人用TR的核心的核心 序列为探针进行序列为探针进行RFLP 分析时，检测到许多分析时，检测到许多 HVR，并产生相应的图，并产生相应的图 谱，所得图谱具有高度谱，所得图谱具有高度 的个体特异性，达到了的个体特异性，达到了 如同人类指纹那样的高如同人类指纹那样的高 度专一性，所以称其为度专一性，所以称其为 DNA指纹图谱（指纹图谱（DNA fingerprinting）。）。 Alec John Jeffreys Oxford, United Kingdom 目目 录录 目目 录录目

45、目 录录 人类人类DNADNA指纹图指纹图 目目 录录 目目 录录 二、二、DNA指纹与法医学诊断指纹与法医学诊断 n个体识别和亲子鉴定：个体识别和亲子鉴定： DNA指纹技术是从指纹技术是从 基因水平检测基因水平检测DNA的高度多态性，个体识的高度多态性，个体识 别率高。别率高。 n以往在刑事案件的法医学鉴定中应用的是血以往在刑事案件的法医学鉴定中应用的是血 型、血清蛋白型、红细胞酶型和型、血清蛋白型、红细胞酶型和HLA分型，分型， 个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统 一认证。一认证。 目目 录录 目目 录录 法医案检中的基因诊断技术法医案检中的基因诊

46、断技术 nVNTR（可变数目串联重复序列（可变数目串联重复序列/小卫星）的小卫星）的 核酸分子杂交分析核酸分子杂交分析 nSTR（短串联重复序列（短串联重复序列/微卫星）的微卫星）的PCR分分 析析 nSNP的基因芯片检测的基因芯片检测 目目 录录 目目 录录 1单位点探针检测及单位点探针检测及PI值的计算值的计算 父权指数（父权指数（Paternity Index，PI）值、父）值、父 权相对指数或亲子关系概率值计算方法基本一权相对指数或亲子关系概率值计算方法基本一 致。致。 PI值表示争议父作为亲父比随机男人作为值表示争议父作为亲父比随机男人作为 亲父的可能性大多少倍，亲父的可能性大多少倍

47、，PI值大于值大于1表示倾向表示倾向 肯定父子关系，数值越大，可能性越大；等于肯定父子关系，数值越大，可能性越大；等于 0时表示排除父子关系时表示排除父子关系。 目目 录录 目目 录录 2DNA指纹图与亲权鉴定指纹图与亲权鉴定 多位点多位点VNTR系统和系统和DNA指纹图的电指纹图的电 泳分离后片段数目较多，各等位基因频率泳分离后片段数目较多，各等位基因频率 分布的计算复杂，进行亲权鉴定和个体识分布的计算复杂，进行亲权鉴定和个体识 别时匹配概率的计算影响因素较多，目前别时匹配概率的计算影响因素较多，目前 尚无一个公认的最合理的计算方法。尚无一个公认的最合理的计算方法。 目前解决亲权纠纷最简单的

48、办法是先在目前解决亲权纠纷最简单的办法是先在 孩子孩子DNA指纹图中找出非母片段并计数为指纹图中找出非母片段并计数为P， 然后分析争议父然后分析争议父DNA指纹图，看指纹图，看P条非母带条非母带 在争议父中出现多少条。在争议父中出现多少条。 目目 录录 目目 录录 亲权鉴定与亲权鉴定与DNA指纹图指纹图 由此图可推断出：由此图可推断出：A和和C是亲生女儿；是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；为妻子和其前夫所生；D为养女。为养女。 第六节第六节 基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy 目目 录录 n基因治疗：基因治疗：指将

49、目的基因通过基因转移指将目的基因通过基因转移 技术（病毒载体介导或者非病毒载体介技术（病毒载体介导或者非病毒载体介 导的基因转移技术）导入靶细胞内，目导的基因转移技术）导入靶细胞内，目 的基因表达产物对疾病起治疗作用。的基因表达产物对疾病起治疗作用。 目目 录录 狭义基因治疗：狭义基因治疗：指目的基因导入靶细胞后与宿指目的基因导入靶细胞后与宿 主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部 分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。 广义基因治疗：广义基因治疗： 外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物外源正常

50、基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物 以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质； 采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因；采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因； 将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物； 向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存 在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到 治疗疾病的目的。治疗疾病的目的。 目目 录录 本节内容提要本节内容提要 一、基因治疗的策略一、基因治

51、疗的策略 二、基因转移技术二、基因转移技术 三、基因干预三、基因干预 四、基因治疗的应用研究四、基因治疗的应用研究 五、基因治疗的前景与问题五、基因治疗的前景与问题 目目 录录 目目 录录 基因治疗分类基因治疗分类 体细胞体细胞(somatic cell)基基 因治疗因治疗 生殖细胞生殖细胞(germline)基基 因治疗因治疗 v只限于某一体细胞的只限于某一体细胞的 基因的改变基因的改变 v只限于某个体的当代只限于某个体的当代 v对缺陷的生殖细胞进对缺陷的生殖细胞进 行矫正行矫正 v当代及子代当代及子代 目目 录录目目 录录 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略 目目 录录 （一）基因置换（

52、一）基因置换（gene replacement） 定义：定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通指将特定的目的基因导入特定细胞，通 过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内 原有的缺陷基因。原有的缺陷基因。 目的：目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复， 不涉及基因组的任何改变。不涉及基因组的任何改变。 目目 录录 n定向整合的条件定向整合的条件:转导基因的载体与基因组转导基因的载体与基因组 DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体具有相同的序

53、列。带有目的基因的载体 就能找到同源重组的位点，进行部分基因序就能找到同源重组的位点，进行部分基因序 列的交换。列的交换。 n基因同源重组技术又称为基因同源重组技术又称为基因打靶基因打靶(gene targeting） n细胞内基因同源重组的发生率很低。细胞内基因同源重组的发生率很低。 基因同源重组技术基因同源重组技术 目目 录录 （二）（二） 基因添加基因添加（gene augmentation） 定义定义: : 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。不表达的基因。 类型类型: : n在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，在有缺陷基因的细胞中导

54、入相应的正常基因， 而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正 常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； n向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因， 利用其表达产物达到治疗疾病的目的。利用其表达产物达到治疗疾病的目的。 目目 录录 （三）基因干预（三）基因干预（gene interference） 定义：定义： 采用特定的方式抑制某个基因的表达，采用特定的方式抑制某个基因的表达， 或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表 达，以达到治疗疾病的目的。达，以

55、达到治疗疾病的目的。 目目 录录 n定义：定义：将将“自杀自杀”基因导入宿主细胞中，这基因导入宿主细胞中，这 种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化 为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀自杀” 效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。 n应用：应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。 （四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy) 目目 录录目目 录录 自杀基因的作用机制自杀基因的作用机制 目目 录录 TK/GCV 单纯疱疹病毒

56、（单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（型胸苷激酶（thymidine kinase, tk） 基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类 似物丙氧鸟苷（似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒转变成毒 性性GCV三磷酸核苷，后者能抑制三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶聚合酶 活性，导致细胞死亡。活性，导致细胞死亡。 1.自杀基因系统自杀基因系统 目目 录录 定义定义: “自杀基因自杀基因”导入后，不仅使转导了导入后，不仅使转导了 “自杀基因自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，的肿瘤细胞在用药后被杀死，

57、 而且与其相邻的未转导而且与其相邻的未转导“自杀基因自杀基因”的肿瘤的肿瘤 细胞也被杀死。细胞也被杀死。 2. 旁观者效应（旁观者效应（bystander effect） 目目 录录 （五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC 基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的 抗癌免疫反应。抗癌免疫反应。 目目 录录 二、基因转移技术二、基因转移技术 基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径 载体载体 目的基因目的基因 in vivo ex vivo靶细胞 目目 录录 目目 录录 基因转移基因转移(gene

58、transfer)技术技术 1.病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移非病毒介导的基因转移 目目 录录 1. 1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病毒载体病毒载体介导的基因转移效率较高，因介导的基因转移效率较高，因 此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计， 有有72%72%的临床实验计划和的临床实验计划和71%71%的病例使用了的病例使用了 病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载 体体。 目目 录录 反转录病毒的结构及生活周期反转录病毒的结构及生活周期 （1 1）反转录病毒）反转

59、录病毒 目目 录录 p两端各有一长末端重复序列两端各有一长末端重复序列LTR。 反转录病毒前病毒的结构特点反转录病毒前病毒的结构特点 pLTR由由U3、R和和U5三部分组成。三部分组成。 p病毒有三个结构基因病毒有三个结构基因 p5端端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（下游有一段病毒包装所必需的序列（）及剪接）及剪接 供体位点供体位点(SD)和剪接受体位点和剪接受体位点(SA)。 p含有负链含有负链DNA转录的引物结合位点转录的引物结合位点(PBS)和正链和正链DNA转录转录 的引物结合位点的引物结合位点。 l在在U3内有增强子和启动子；内有增强子和启动子； l U3和和U5两端分别有病毒

60、整合序列两端分别有病毒整合序列(IS) ； l 在在R内还有内还有poly(A)加尾信号。加尾信号。 lgag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；基因，编码核心蛋白和属特异性抗原； lpol基因，编码反转录酶；基因，编码反转录酶； lenv基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白 (包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。 目目 录录 反转录病毒介导的基因转移系统反转录病毒介导的基因转移系统 由两部分组成由两部分组成 反转录病毒载体：反转录病毒载体：其基因组为缺陷型，保留了病毒其基因组为缺陷型，保留了病毒 的包装信号的包装信号，而缺失病毒的包装蛋白基因；它可，而缺