基础学习实验 1-高锰酸钾吸收曲线绘制 双缩脲法测定蛋白质

1、E 高锰酸钾吸收曲线绘制高锰酸钾吸收曲线绘制 E 双缩脲法测定蛋白质双缩脲法测定蛋白质 E 蛋白质各种定量方法优缺点的比较蛋白质各种定量方法优缺点的比较 综合性设计性实验综合性设计性实验-1-1 此实验共包括如下三个部分此实验共包括如下三个部分 1. 1. 第一部分：第一部分：高锰酸钾吸收曲线绘制高锰酸钾吸收曲线绘制 2. 2. 第二部分：第二部分：双缩脲法测定蛋白质双缩脲法测定蛋白质 3. 3. 第三部分：蛋白质各种定量方法优缺点的比较第三部分：蛋白质各种定量方法优缺点的比较 试剂使用规则试剂使用规则 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。使用试剂前应该仔细辨认标签，

2、看清名称及浓度，是否为本实验所需。 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。 取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液， 以免污染瓶中的标准液体。以免污染瓶中的标准液体。 使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取， 切勿用嘴吸取，

3、以免造成意外。切勿用嘴吸取，以免造成意外。 吸量管的使用吸量管的使用 正确拿法正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。 移液管的使用移液管的使用：使用时应根据需量取的液体体积，选用能一次吸取即可的最小：使用时应根据需量取的液体体积，选用能一次吸取即可的最小 规格的移液管，以减少误差，如用规格的移液管，以减少误差，如用5 ml移液管吸取移液管吸取4.5 ml蒸馏水，用蒸馏水，用0.5 ml的的 移液管吸取移液管吸取0.5 ml 0.0125%的高锰酸钾溶液。取液：用吸耳球吸取液体至刻度的高锰酸钾溶液。取液：用吸耳球吸取液体至刻度 上，眼

4、睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。 调刻度调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控 制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 放液放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角 度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体

5、自动流出。吸量管应最后靠壁15秒。秒。 吸量管上端标有吸量管上端标有“吹吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于 管尖的溶液。此类吸量管为管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式吹出式”，未标，未标“吹吹”字的吸量管，则不字的吸量管，则不 必吹出管尖的残留液体，必吹出管尖的残留液体，0.5ml 以下的都要吹。以下的都要吹。 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污 染吸量管及试剂。染吸量管及试剂。 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用吸取血液、尿

6、、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用 自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验 完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。 吸量管的使用注意事项吸量管的使用注意事项 一般玻璃仪器一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣 粉刷洗，再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗粉刷洗，再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗2 23 3次，干燥备用。次，干燥备用。 容量分析仪器容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等

7、，先用自来水冲洗，待晾干：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干 后，再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水后，再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水 淋洗淋洗2 23 3次，干燥备用。次，干燥备用。 比色杯比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲 洗，再用自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗洗，再用自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗 糙布糙布( (纸纸) )擦拭。擦拭。 上述所有玻璃器材洗净上述所有玻璃器材洗净( (以倒置后器壁

8、不挂水珠为干净的标准以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准) )后，根据后，根据 需要晾干或烘干。需要晾干或烘干。 玻璃器皿的清洗方法玻璃器皿的清洗方法 分光光度法分光光度法 光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。 人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在400760nm，人的眼睛感觉不到的，人的眼睛感觉不到的 还有红外光（波长大于还有红外光（波长大于760-5000000nm）、紫外光（波长）、紫外光（波长200-400nm）、）、X射线等。射线等。 在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间

9、并没有严格的界线，而在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间并没有严格的界线，而 是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。 溶液的颜色与吸收光颜色的关系溶液的颜色与吸收光颜色的关系 Beer-Lambert定律吸收光谱法基本定律定律吸收光谱法基本定律 描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。 含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。 AKCL 或或 lgI0/I =KCL A A为溶液对

10、光的吸光度为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度；，反映了物质对光的吸收程度； C C为溶液浓度为溶液浓度； L L为溶液厚度为溶液厚度； I I0 0为照射待测物质的单色光强度，为照射待测物质的单色光强度，I I为透过待测物质光线的光强度为透过待测物质光线的光强度，透光度，透光度 T= I/IT= I/I0 0即溶液透过光的强度与入射光的强度之比；即溶液透过光的强度与入射光的强度之比； K K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。 实验中溶液厚度不变，则实验中溶液厚度不变，则A AKCKC 光吸收示

11、意图光吸收示意图 I I0 0I I b C C 吸收光谱和物质的定性分析吸收光谱和物质的定性分析 物质的吸收光谱与物质分子结构有关。物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度 （Absorbance），），然后以波长（然后以波长（）为横轴，相应的吸光度（为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图，为纵轴，按结果作图， 可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的

12、光的吸收能力。 在一定的温度、在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可 找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（max）。）。物质不同，它物质不同，它 们的最大吸收波长也往往不同。们的最大吸收波长也往往不同。 不同浓度不同浓度的的VitB12溶液对相同波长的光的不同吸收溶液对相同波长的光的不同吸收 g/ml A 550nm 原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶

13、液的定性检测 比较吸收光谱曲线比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学 结构不同。结构不同。 比较最大吸收波长比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最 大吸收波长相同，吸收系数不同。大吸收波长相同，吸收系数不同。 比较吸光度的比值比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定纯度鉴定) 物质定性分析常用方法物质定性分析常用方法 物质的定量分析物质的定量分析 标准曲线法标准曲线法 配制

14、一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入配制一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入 射光。测定时先以空白溶液调节透光率射光。测定时先以空白溶液调节透光率100%100%，然后分别测定标准系列的吸光，然后分别测定标准系列的吸光 度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做 标准曲线（或称标准曲线（或称A-CA-C曲线）。曲线）。 标准管法标准管法 对个别样品进行测定，且对个别样品进行测定，且A-CA-C曲线线性良好直接比较测定结果。曲线线性良好直接比较测定结果。

15、A标 标 =K标标c标标b标标 A测 测 =K测测 c测测 b测测 c测 测 =A测测 /A标标 c标 标 分光光度计的基本构造分光光度计的基本构造 仪器中光源经过单色器中的单色原件（如棱镜），所得到的单色光（入射光）进入仪器中光源经过单色器中的单色原件（如棱镜），所得到的单色光（入射光）进入 样品室，透出的光被受光器（光电池或光电色）产生光电流，放大后在测量仪上显样品室，透出的光被受光器（光电池或光电色）产生光电流，放大后在测量仪上显 示出吸光度（示出吸光度（A）或透光度（或透光度（T）。 光光 源源 单色器单色器样品室样品室受光器受光器 测量器测量器 72722 2分光光度计使用方法分光光

16、度计使用方法 接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热10min; 将空白液或对照液及测定液分别装入将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯比色杯3/4体积体积并用擦镜纸擦净外壁，并用擦镜纸擦净外壁， 放入样品室内放入样品室内, 空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位 置对应置对应; 调好波长调好波长; 调节按钮调节按钮 开盖时，调开盖时，调 T 参数参数 调为调为 100 合上盖，调合上盖，调 A 参数参数 调为调为 0; 逐步拉出样品室拉杆（听到逐步拉出样品室拉杆（听到“咔咔”一声）

17、，读取一声），读取吸光度值吸光度值(A）; 读数完打开样品室盖，再将读数写入记录本。读数完打开样品室盖，再将读数写入记录本。 72722 2分光光度计使用注意事项分光光度计使用注意事项 样品室盖应轻开轻放；样品室盖应轻开轻放； 比色皿拿其磨砂面，液体装入约比色皿拿其磨砂面，液体装入约3/43/4高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完 后自来水冲洗干净，倒置于滤纸上；后自来水冲洗干净，倒置于滤纸上； 倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品；倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品； 每调换一次波长，都应将空白溶液的吸光度调至每调换一次波

18、长，都应将空白溶液的吸光度调至“0 0”。 第一部分第一部分 高锰酸钾吸收曲线的绘制高锰酸钾吸收曲线的绘制 实验目的实验目的 掌握分光光度计的原理、操作和应用掌握分光光度计的原理、操作和应用 能够熟练使用移液管能够熟练使用移液管 实验原理实验原理 高锰酸钾水溶液对不同波长的光线可有不同的吸收程度。用高锰酸钾水溶液对不同波长的光线可有不同的吸收程度。用72722 2型分光光度计型分光光度计 测定相应波长下的高锰酸钾吸光度并作图可得吸收曲线，分析高锰酸钾溶液测定相应波长下的高锰酸钾吸光度并作图可得吸收曲线，分析高锰酸钾溶液 的最大吸收波长。的最大吸收波长。 实验操作实验操作 取取0.0125高锰酸

19、钾溶液高锰酸钾溶液0.5m1，加蒸馏水，加蒸馏水4.5ml，作为测定管，作为测定管;另用蒸馏水作为空白管；另用蒸馏水作为空白管； 用用722型分光光度计测定不同波长的吸光度，型分光光度计测定不同波长的吸光度， 从从450nm至至500nm，每隔，每隔10nm； 502nm至至538nm，每隔，每隔2nm； 540nm至至560nm，每隔，每隔10nm； 在座标纸上以吸光度在座标纸上以吸光度(A)为纵座标，波长为纵座标，波长(nm)为横座标，绘制吸收曲线，并指出最大吸收为横座标，绘制吸收曲线，并指出最大吸收 波长；波长； 熟练熟练722分光光度计的操作，在不进行测量时样品室盖应打开；分光光度计的

20、操作，在不进行测量时样品室盖应打开； 两人合作，一人操作分光光度计，一人记录数据。两人合作，一人操作分光光度计，一人记录数据。 第二部分第二部分 双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量 实验目的实验目的 了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度的原理和方法了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度的原理和方法。 蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物， 称为双缩脲反应。称为双缩脲反应。 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性

21、溶液中，能 与与CuCu2+ 2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白 形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白 质的浓度。质的浓度。 在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测 定蛋白质浓度。定蛋白质浓度。 NH O NH NH O NH C C NH O NH O NH C C 加热180 C o +NH 2 2 2 2 2 2 3 实验原理实验原理 蛋白含量检测的临床应用蛋白含量检测的临床应用 紫红色铜双缩脲复合物分子结构紫红色铜双缩脲复合

22、物分子结构 在分光光度法中，许多不吸收光的无色物质可以用显色反应变成有色物质，使之能进行比在分光光度法中，许多不吸收光的无色物质可以用显色反应变成有色物质，使之能进行比 色测定，并能提高测定的灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中，将待测组分转色测定，并能提高测定的灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中，将待测组分转 变成有色化合物的反应叫做显色反应，与待测组分反应生成有色化合物的试剂叫显色剂。变成有色化合物的反应叫做显色反应，与待测组分反应生成有色化合物的试剂叫显色剂。 在实际分析中，同一待测组分可与多种显色剂发生显色反应，生成不同的有色物质。为了在实际分析中，同一待测组分可与多种显

23、色剂发生显色反应，生成不同的有色物质。为了 保证测定的灵敏度和准确度，在分析时常需对显色反应进行选择，选择原则如下：保证测定的灵敏度和准确度，在分析时常需对显色反应进行选择，选择原则如下： 1. 选择性好，干扰少或干扰易消除；选择性好，干扰少或干扰易消除； 2. 灵敏度要高；灵敏度要高； 3. 生成有色化合物的组成恒定，化学性质稳定；生成有色化合物的组成恒定，化学性质稳定； 4. 生成的有色化合物与显色剂之间的颜色须有明显的差别，最大吸收波长之差大于生成的有色化合物与显色剂之间的颜色须有明显的差别，最大吸收波长之差大于60nm。 显色剂与显色反应显色剂与显色反应 管号管号 试剂试剂 0 1 2 3 4 5 6 牛血清标准蛋白溶液（牛血清标准蛋白溶液（ml） 2mg/ml 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 0 待测蛋白液（待测蛋白液（ml） 3.0 蒸馏水（蒸馏水（ml） 3 2.4 1.8 1.2 0.6 0 0 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0未知未知 实验步骤实验步骤 1.1.按下图表所示加入相应的试剂或样品按下图表所示加入相应的试剂或样品 2.各管混匀后加入双缩脲试剂各管混匀后加入双缩脲试剂3.0ml，充