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1、基因工程一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做DNA 重组技术。基因工程的别名基因拼接技术或DNA 重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA 分子水平基本过程剪切拼接导入表达实质（原理）基因重组结果改造的方向克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传特性二、基因工程的基本工具1、限制性核酸内切酶-“分子手术刀”2、 DNA 连接酶 - “分子缝合针”3、基因进入受体细胞的载体- “分子

2、运输车”1 “分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶）（1 ）存在：主要存在于原核生物中。（ 2 ）特性：特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。（3 ）切割部位：磷酸二酯键（4 ） 作用：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。（ 5）识别序列的特点：（6 ） 切割后末端的种类：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。2“

3、分子缝合针” DNA 连接酶（ 1）作用：将限制酶切割下来的DNA 片段拼接成 DNA 分子。（ 2）类型种类E coliDNA 连接酶T 4DNA 连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能只能将双链 DNA 片段互补缝合两种末端，但的黏性末端之间的磷酸二连接平末端之间的特性酯键连接起来效率较低相同点：都连接磷酸二酯键3 “分子运输车 ”载体(1)载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA 片段插入。具有标记基因，供重组DNA 的鉴定和选择。(2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状 DNA 分子。(

4、3)其他载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒。(4)载体的作用 :作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。在受体细胞内对目的基因进行大量复制。【解题技巧】(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。(5)不同 DNA 分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA 分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标

5、记基因，以便于进行检测。(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA 分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8)基因工程中有3 种工具，但工具酶只有2 种。例 1限制酶Mun 和限制酶EcoR 的识别序列及切割位点分别是C AATTG 和 G AATTC 。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是（）A限制酶的应用特点（ 1）在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但是如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，

6、 在 DNA 连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。（ 2）为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接， 可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端五种酶的比较作用底物作用部位形成产物限制性内切酶DNA 分子磷酸二酯键黏性末端或平末端DNA 连接酶DNA 片段磷酸二酯键重组 DNA 分子DNA 聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键子代 DNADNA 解旋酶DNA 分子碱基对间的氢键脱氧核苷酸单链RNA 聚合酶核糖核苷酸磷酸二酯键核糖核苷酸单链三、基因工程的操作步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定1、目

7、的基因的获取获取目的基因的方法：（ 1）直接分离法从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA 短片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。包括基因组文库和cDNA 文库。直接从基因组中获取目的基因最常用的方法是：“鸟枪法 ”。（ 2）人工合成法化学合成法：片段较小，核苷酸序列已知的目的基因，直接利用DNA 合成仪用化学方法合成，不需要模板。反转录法：以RNA 为模板，在逆转录酶作用下合成目的基因DNA （ cDNA ）。（ 4）利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 技术：是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。由于 PCR

8、过程在高温下进行，因此需要使用热稳定的DNA 聚合酶。目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因前提：要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。2基因表达载体的构建 基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(3) 基 因 表达载体的构建过程：3将目的基因导入受体细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的关键是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。金榜P185生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转将目的基因插

9、入到Ti 质粒的 T 将含有目的基因的表达载体Ca2处理细胞感受态细胞化 DNA 上农杆菌导入植物细胞提纯取卵 ( 受精卵 ) 显微 重组表达载体与感受态细过整合到受体细胞的染色体DNA 注射受精卵发育获得具胞混合感受态细胞吸收程上表达有新性状的动物DNA 分子4目的基因的检测与鉴定误区警示 (1)标记基因的作用 筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因 (表达产物为带颜色的物质)等。(2)受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养 )、动物受精卵 (一般不用体细胞)、微生物 (大肠杆菌、酵母菌 )等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网

10、、高尔基体的加工、分泌 )；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。(3) 基因表达载体中，启动子 (DNA 片段 )起始密码子 (RNA) ；终止子 (DNA 片段 )终止密码子(RNA) 。基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。(4)目的基因与载体的连接方式有多种，如目的基因目的基因、目的基因载体、载体载体等。例 3.下列有关基因工程操作的叙述中，正确的是()AA用同种限制酶切割载体与目的基因可获得相同的黏性末端B以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同C检测到受体细胞含有目的基因就标志着基

11、因工程操作的成功D用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接例 4 金榜 P187 T2四、基因工程的应用与蛋白质工程1乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较(1)含义：乳腺生物反应器是指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。(2)两者区别：比较项目乳腺生物反应器工程菌动物基因的结构与人类基细菌或酵母菌等生物基因的结构与人基因结构因的结构基本相同类基因的结构有较大差异合成的药物蛋白与天然蛋细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细基因表达白质相同胞器，产生的药物蛋白可能没有活性受体细

12、胞动物的受精卵微生物细胞导入目的基显微注射法感受态细胞法因的方式不需严格灭菌，温需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温生产条件度等外界条件对其度、pH 、营养物质浓影响不大度等外界条件药物提取从动物乳汁中提取从微生物细胞中提取2蛋白质工程与基因工程的比较（金榜 P189 ）区别与蛋白质工程基因工程联系预期蛋白质功能设获取目的基因构计预期的蛋白质结构建基因表达载体过程推测应有的氨基酸将目的基因导入受序列找到相对应的体细胞目的基因脱氧核苷酸序列的检测与鉴定定向改造或生产人类定向改造生物的遗传特实质性，以获得人类所需的所需的蛋白质生物类型或生物产品结果可生产自然界没有的只能生产自然界已有的蛋白质蛋白质蛋

13、白质工程是在基因工程基础上延伸出来联系的第二代基因工程基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。3、基因工程的应用：金榜 P1894、基因治疗：（ 1）概念：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。（ 2）方法：基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。如：腺苷酸脱氨酶（ ADA ）基因缺陷症的基因治疗。（ 3）基因治疗的途径体外基因治疗：先从病人的体内获得某种细胞进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的

14、细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。如腺苷酸脱氨酶基因的转移。体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。5、基因诊断（ 1）概念：又称 DNA 诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。（ 2）方法： DNA 分子杂交技术。它的基因原理是：互补的DNA 单链能够在一定条件下结合成双链，即能够杂交，这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对的原则进行。当用一段已知基因的单链作探针（常用同位素、荧光分子等进行标记），与变性后的单链基因组DNA 接触时，如果两者的碱基完成配对，互补地结合成双链，表明被测基因组DNA 中含有已知的基因序列。误区警示 (1)基因治疗后，缺陷基因没有改变。基因治疗是把正常基因导入受体细胞中，以表达正常产物从而治疗疾病，对原来细胞中存在缺陷的基因没有清除或改变。(2)对蛋白质分子进行改造，其本质是改变其基因组成。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质分子还是无法遗传。(3)DNA分子作探针进行检测时应检测单链，即将待测双链DNA分子打开。(