荧光抗体技术

1、第二节 荧光抗体技术一、荧光抗体的制备（一）抗体的荧光素标记用于标记的抗体，要求是高特异性和高亲和力的。所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。一般需经纯化提取igg后再作标记。作为标记的荧光素应符合以下要求：应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种。以 fitc 标记为例，搅拌标记法为：先将待标记

2、的蛋白质 溶液用0.5ml/lph9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入fitc溶液，在室温持续搅拌 46h后，离心，上清即为标记物。此法适用于标记体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短， 荧光素用量少。但本法的影响因素多，若操作不当会引起较台强的非特异性荧光染色。透析法适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含 fitc 的 0.01mol/lph9.4 碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再 对 pbs 透析法去除游离色素。低速离心，取上清。标记完成后，还应对标记抗体进一步纯化以去除未结合

3、的游离荧光素和过多结合荧光素的抗体。纯化方法 可采用透析法或层析分离法。二）荧光抗体的鉴定荧光抗体在使用前应加以鉴定。鉴定指标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者较为理想。荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算的基本方法是：将制备的荧光抗体稀释至a28o1 1.0，分别测读a28o （蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰,按公式计算。按公式计算。图3-8RB200标记抗体反应（三）四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC )它是一种紫红色粉末， 较稳定。其最大

4、吸收光谱为 550nm ,最大发射光谱620nm ,呈橙红色荧光，与FITC 的黄绿色荧光对比清晰（图3-9），与蛋白质结合方式同 TITC。它可用于双标记示踪研究。化学结构式如下（图 3-10 ）。图3-9 TMRITC在可见光区的吸收光谱和发射光谱荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加O.OImg图3-10 TMRITC结构式、荧光素标记抗体的方法（一） FITC标记抗体的方法1. Marsshall 氏法（1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/LpH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（2550ml ）、冰及冰槽（或1000ml烧杯

5、）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml八 pH7.2或8.0的 0.01 mol/L PBS 等。（2）方法及步骤： 抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不 起泡沫为宜）510min荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约510min内加完），加毕后，继续搅拌 1218h。结合期间应保持蛋白溶液于

6、4C左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在 透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（04C）过夜。 过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶行鉴定（图3-11，图-3-12 ）。4 C冰箱或冰库中。2500r/min ） 20min，除去其中少量之沉淀物，装入透析袋中G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进图 3-11 Sephadex G-25 对 FITCuHi $.一一一-说阳.o12It何f h图 3-12FITC与家兔IgG球蛋白在25 C和2C时结合的动力学（Kawamura1964 )洗脱液：0.01mol/L磷酸盐缓

7、冲液（pH7.2 ）;过滤量:12ml标记全球蛋白液（过滤前未透析）;收集量:20ml（稀释1.7倍）。分别以1mgFITC 溶于2份1mol0.5mol/L碳酸重碳酸盐缓冲液（分别为pH9.5和pH9.0 ），于2C下搅拌将其各加入 100mg家兔IgG生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分为两半。一半保留于2C下，另一半置 25 C下。间隔一定时间后各取出 0.5ml 通过 sephadexG-25去游离FITC，由上计算出5mg家兔IgG结合的FITC量。2. Chadwick 氏法1）材料：抗原球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、 0.01mol/LPh8.0 磷酸盐缓冲盐水、

8、 1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶（ 25ml ）、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、 烧杯（ 500ml ）、透析袋、棉线、玻棒等。（2 ）方法及步骤： 抗体准备：用o4CpH8.0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为3040mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。 荧光色素准备：按每毫克蛋白加入荧光素 0.01mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶 解。 将准备之抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在04C,冰箱中结合1824h。 透析和柱层析：方法同 Marshall氏法。3改良法（ 1963 年） 根据 Marshall氏法取高价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水

9、（ 0.15mol/LNaCl ）及缓冲液（ 0.15mol/LNaHC03 -la2CO3 PH9.0 ）稀释使每毫升内含蛋白10mg,缓冲液为总量的10%，降温至4C,加入异硫氰酸盐荧光素，（蛋白：荧光素 =5080mg:1mg ），在04C下电磁搅拌1214h。然后用半饱和和硫 酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用0.01%,Nessler 氏试剂测验至隔夜透析之盐水无氨离子及荧光色素为止）。将制备好的荧光抗体加叠氮钠分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4C）可以用半年以上，-20C保存可达2年以上。【附一】 0.01mol/L pH7.2

10、 PBS 配法： NaCl18g 、 Na2HPO41.5g 、 KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸馏水中，校定 pH至7.2。【附二】 0.5mol/L pH9.0 碳酸盐缓冲液配法：取 0.5mol/LNa2CO3（5.3%）10ml 加入 0.5mol/LNaHCO3（4.2%）90ml, 混合后，校定 pH 至 9.0。【附三】 3%重碳酸钠水溶液配法：称 1.5g 无水重碳酸钠充分溶解于 50ml 灭菌蒸馏水中即成。4透析标记法此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。（1 ）用 0.025mol/L 碳酸盐缓冲液 pH9.0 ，将欲标记免疫球蛋白稀释成1%浓

11、度，装入透析袋中。（2）用同一缓冲液将 FITC 配成 0.1mg/ml 的溶液，按 1 %球蛋白液体积的 10倍，将 FITC 稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4C电磁搅拌下，透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用sephadex G-50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装、贮存于4C中（图3-13 ）-图3-13 标记抗体溶液通过 sephadex产胶柱层析分布（二）四乙基罗达明标记抗体方法取 1g RB200 及 PCL52g放在乳钵中研磨5min （在通风橱中）。然后加入 10 ml无水丙酮，放置5min，不断搅拌。过滤，用滤液进行标

12、记抗体剩余部分吸附在滤纸上，4 C干燥保存。取抗体（20mg/ml ）每毫升加入生理盐水和 0.5mol/L pH9.0的碳酸盐缓冲液各1ml稀释。逐滴加入0.1mlRB200溶液，边加入边搅拌，在04C中结合1218h，再用生理盐水透析 57h，经葡聚糖凝胶 G-50柱层析，除去游离荧光素，分装，贮存于4C备用三）四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法1 ) IgG10ml (6mg/ml) 在 0.01mol/L pH9.5 碳酸盐缓冲液中透析过夜。（2）将四甲基异硫近氰酸罗达明（每毫克IgG加入520卩g）溶于二甲亚砜（1mg/ml ）,取此溶液300卩l，一滴一滴加入蛋白质溶液中，同时电磁搅

13、拌。（3）在室温中搅拌2h，避光4 ）把结合物移入直径 3 cm, 高 30cm 大小的 Bio-Gel P-6 层析柱(用 0.01mol/L pH8.0 的 PBS 平衡过），流速为 1.5ml/min（5）收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，分装，4C保存备用四）藻红蛋白标记抗体的方法1 巯基化藻红蛋白（ phycoerthrinPE)的制备，600卩的15.5mg/ml 盐酸巯醇亚胺( iminothiolanehydrochloride )加到1.2ml 的 3.6mg/ml 的 PE 中，和 1.2mlPB 、pH6.8 混合，装入透析袋置入 50mmol/LpH6.8 PB中透

14、析，4C过夜，再换用pH7.5PB透析6h。每个PE分子中可结合8个巯基。2PE-IgG 制备 异双功能试剂 SPDPN-Succ - inimdyl 3-(2- pyridyldlthio) propinate 30卩 l(1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入 700卩啲4.2mg/mlIgG PB 溶液( 50mmol/LpH7.5 )，在室温中反应 2.5h。再加入巯基化 PE400 11 l 1.7mg/ml )加到500 gl反应混合液中，室温反应12h，加入100 gl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，用PB透析过夜，4C。加入0.01%Na3N3分装，4C保存半年。(五)PE

15、-标记蛋白A方法1）取 4.08mgPE 溶于 0.1mol/L pH7.4PB （含 0.1mol/LNaCI ） 1ml中，溶解后，取出 0.5ml，再加入10卩ISPDP无水甲醇液（2.65mg/ml ） ,SPDP/蛋白摩尔比为10， 22 C 反应 5min，过 SephadexG-50（1 x 17cm）,用 100mmol/LpH7.4 PBS （含 0.1mol/LNaCl ）平衡和洗脱。（2） 0.5ml 蛋白（ 2mg/ml ） 100mmol/LPB（含有 100mmol/LNaCl） pH7.4，加入 2.6 卩止述 SPDP 甲醇液，SPDP :蛋白=9.5,22 C

16、 ,40min，加入25卩mol/L二硫苏糖醇（DTT ） pH7.4缓冲液，22 C，25min，同上过 SephadexG-50 ，收集蛋白 A 峰。（3 ）取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22 C反应6h，混合物4C保存备用。以上两种 PE 标记制品，可最后溶于 0.01mol/LpH7.4PB（ 含有 0.1mol/LDETA 、1mol/L 碘乙酰胺、 1%BSA 和 0.1%NaN3),0 5C保存六）蓝色荧光素标记抗体方法Kbaffan 等（ 1986 ）首先创立了蓝色荧光素标记和染色技术，可进行双标记或多标记1）取 7-氨基 -4-甲基香豆素（ 7

17、-amino-4-methyl coumarin, AMC ) 260 溶于二甲亚砜 25卩中2 ）将上液加入 10mlIgG的 巴比妥缓冲液（0.5mol/L,pH8.5,内含50100mgIgG ）中，室温反应 2h，过SephadexG-50 除去游离荧光素AMC 呈黄色结晶固体，最大吸收波长 354nm, 最大荧光波长 430nm三、荧光抗体质量控制对制备的荧光抗体必须进行质量鉴定，主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。一）染色特异性和敏感性的测定1 特异性染色效价的测定直接染色以倍比稀释荧光抗体溶液如1 : 2, 1 : 4, 1 : 8，与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“ +

18、”的最大释释度，即为该荧光抗体的染色滴度（效价）或单位。实际染色应用时，可取低一个或两个稀释度（即24个单位），如染色效价为 1 : 64，实际应用时可取1 : 32或1: 16。间接染色效价可按抗核 抗体荧光染色法步骤，先用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以抗核抗体荧光强度“+”为标准，染色用效价和直接法相同。2非特异性染色测定根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异染色滴度，否则应采取消除非特异性染色的 方法处理荧光抗体。3. 吸收试验在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移入4C中过夜，3000

19、r/min,离心 30min ，收集上清液，再用以染相应抗原阳性标本，结果应不出现明显阳性荧光。4. 抑制试验如前述。（二） F/P 比值的测定F （荧光素）和P （抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F/P的克分子比值为12。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。1. 蛋白质定量测定荧光抗体的蛋白质 mg/ml 量。2. 结合荧光素定量先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取 FITC1mg, 溶于 10ml0.5mol/L pH9.0 碳酸盐缓冲液中，再用 0.01mol/LPH7.2PBS稀释到100ml，此时荧光素含量为10卩g/ml，以此为原液，再倍比稀释9个不同浓度的溶液,用分光光度计在490nm波长测定光密度值（OD），以光密度为纵坐标，荧光素含量为横坐标，作标准函 数图荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约 5nm,FITC和蛋白质结合后由490nm变为 493495nm，RB200和蛋白质结合后变为 595nmF/P比值的计算：可按以下公式计算。HKHOC -Hl 比