病毒滴度测定本

1、编辑版 word可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。记为 1E+1 uL ；所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0uL ；所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1uL所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5uL所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6uL第一个 Ep 管中加入 10uL 病毒原液，第二个 Ep 管中进行了第一次十倍稀释，第三个 Ep 管中进行了第二次十倍稀释，依次类推第七个 Ep 管中进行了第六次十倍稀释，第八个 Ep 管中进行了第七次十倍稀释，换句话说： 如果在加入 1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到 3 个带有荧光的细胞， 说明该孔

2、中至少有 3 个病毒 颗粒感染了细胞， 则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量， 本例子中就是 3/(1E-5)=3E+5 单位为 TU/ uL ，也就等于 3E+8 TU/mL 。稀释计数法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。TU为transducing units的缩写，中文为转导单位 ，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。第一天 细胞准备将生长状态良好的 293 T细胞消化计数后稀释至1X 100 OOO/mL，加入96孔板，100丄/孑L,为每个病毒准备10个孔。放入37C，5%二氧化碳培养箱中培养。第二天 加病毒在 EP 管中做 10 倍

3、梯度稀释，连续 10 个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备 10 个 1.5mL EP 管， 每管加入90丄 培养液，往第一个管中加入 10 pL病毒原液，混匀后，吸取 10丄加入第二个管混匀。 依此类推，做十个稀释度( 10 0.00000001)。吸取 96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。第三天 追加培养液在每个孔再加入 100 pL 完全培养液，利于细胞的生长。第四天 观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y,则滴度(TU/mL )=(X+Y X 10)X 1000/2/X 孔的病毒液的含量(p L)。定量 PC

4、R 法病毒感染 1 天前，取 6 孔板接种 HOS 细胞。每孔细胞为 5X100 000 个。接种细胞 24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N 。弃去其他培养板中的培养基， 更换为含有 5 pg/mL polybrene 的新鲜培养基。 将浓缩病毒用培养基稀释 200 倍，也就是取 1pL病毒加入到 199pL的培养基中。在 3 个培养孔中分别加入 0.5pL，5pL和 50pL的稀释病毒。感染开始后20小时，除去培养上清，换为500 pL含DNasel的新鲜培养基。在 37C消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为2 mL正常的培养基，继

5、续培养48小时。用0.5 mL 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在 37C放置1分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按 照 DNeasy 试剂盒的说明抽提基因组 DNA 。每个样品管中加入 200 pL 洗脱液洗下 DNA 。用 DNA 定 量试剂盒定量(Bio-Rad)。基因组 DNA可以稳定保存在 -20C至少两个月。准备PCR所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管I:Forward primer ( 100 pmol/mL )： 0.1pL X nReverse primer (100 pmol/mL )： 0.1pL X nProbe (100 pmol/mL) ： 0.1p

6、L X n水： 19.7 pL X nn = number of reactions。例如：总反应数为 40,将 1 mL 2X TaqMan Universal PCR Master Mix, 4 p_ forward primer, 4丄reverse primer, 4丄probe和788丄水混和。震荡后放在冰上。2X TaqMan Master Mix： 25 pl_ x n10X RNaseP primer/probe mix: 2.5 山 x n水：17.5 pl_ x nn = number of reactions。例如：总反应数为40,将 1 mL 2 x TaqMan Un

7、iversal PCR Master Mix, 100 丄 10x RNaseP primer/probe mix和 700 pL水混和。震荡后放在冰上。在预冷的96孑L PCR板上完成PCR体系建立。从总管 I中各取45山加入到 A-D各行的孔中，从 总管II中各取45 mL加入到E-G各行的孔中。分别取 5 pL 质粒标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 A-D 行中,每个样品重复 1 次。另留 1 个孔 加入 5 pL 的水做为无模板对照（ no-template control）。分别取 5 pL 基因组标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 E-G 行中,每个样品重复 1 次。另留

8、 1 个 孔加入 5 pL 的水做为无模板对照（ no-template control）。所使用定量 PCR仪为ABI PRISM 7000定量系统。循环条件设定为：50C 2分钟，95C 10分钟，然后是95C 15秒，60C 1分钟的40个循环。数据分析：测得的 DNA 样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒 拷贝数。滴度（ integration units per mL， IU/mL ）的计算公式如下：IU/mL= （C xNx Dx 1000）/V其中： C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数； N = 感染时细胞的数目（约为 1x100000）D =

9、 病毒载体的 稀释倍数 ；V = 加入的稀释病毒的体积数。96孔板病毒滴定实验方法总结一看了前面一个关于病毒滴定方法的帖子 ,自己也做过不少次 ,所以想写出一点儿 ,算是个总结 ,希望能对各位有 所帮助 .这里我写 2 种方法 ,一种是在稀释好的病毒液里加细胞悬液 .另一种是在长成单层的细胞上 ,加入已经 稀释好的病毒液 .这两种方法我都做过 ,效果各有长处 .1. 一个确定的地方是 ,所用细胞是贴壁生长 ,所以在维持液或者生长液中都不能加入胰酶,这一点和流感病毒病毒滴定测定有很大不同 ;2. 稀释液配方：MEM（或DMEM）+1%双抗+NaHCO3（加入量由所需要 pH值确定，一般以加到pH

10、7.0为主，可用 pH试纸测定,NaHCO3的浓度为6%）.另,MEM,或DMEM的选择由所培养的宿主细胞决定 ；3. 细胞悬液为细胞+生长液（MEM+10%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3）.在加细胞悬液的病毒滴 定测定方法中 ,如果不加入细胞生长液 ,则细胞无法贴壁 ；方法一 .在稀释好的病毒液中加入细胞悬液：1. 一个确定的地方是 ,所用细胞是贴壁生长 ,所以在维持液或者生长液中都不能加入姨酶,这一天和流感病毒病毒滴定测定有很大不同 ；2. 稀释液配方:MEM（或DMEM）+1%双抗+NaHCO3（加入量由所需要 pH值确定，一般以加到pH7.0为主，可用 pH试纸测定,N

11、aHCO3的浓度为6%）.另,MEM,或DMEM的选择由所培养的宿主细胞决定 ；3. 细胞悬液为细胞 +生长液 :MEM+10%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3加细胞悬液的病毒滴定测定方法中 ,如果不加入细胞生长液 ,则细胞无法贴壁 ；4.96孔板上做 10倍稀释病毒 ,从10-1开始,一般做 5-6个稀释度 ,即到 10-5或10-6即可,每孔 25微升,每个稀释 度做 4孔,或者 8孔,一般做 4孔即可；5.消化细胞 ,并用生长液反复吹打细胞 ,使细胞充分混允 ,放入双碟 ,用排枪将细胞悬液加入相应孔中,每孔 100 微升;6.细胞对照孔 :125 微升细胞悬液 ,不加病毒

12、;7.关于 96 孔板,每孔接种的细胞量 :一般在此种测定病毒滴度的方法下 ,要将细胞密度适当调低 ,至少要比正常 传代时低一些 ,否则细胞生长速度过快 ,未到 7 天则细胞出现死亡 ,对观察 CPE 不利 .一般情况下 ,小塑料瓶 （8-9ml液体为正常用量），培养长慢单层后，消化细胞，加入6ml培养液，吹匀，吸出其中的2ml,到另外的瓶子，在该 瓶中加入14-16ml即可，如果不放心，可以用显微镜看一下，细胞数过多则补加培养液，少则补加剩余4ml的细胞 悬液 ;8.37OC,眺CO2培养7天左右，每天观察结果，从出现CPE的第一天开始记录，一般第7天可以计算病毒滴度；9. 计算公式 ，比较

13、复杂 ，明天再附上 ，这里介绍一个简单的计算 TCID50 的方法 :由以上公式求得 0.6加到僅高於 50%感染率稀釋指數 （此例中為10-3 ）得10-3.6即為病毒作10-3.6稀釋後 每0.1ml含1 TCIP50，亦即該病毒之力價為 10-3.6/0.1ml。这里是以每个稀释度 8 孔为例 ，如果做的是 4孔一个稀释度 ，则对应的换一下数字 即可.（这里是转自别人的帖子 ，但是我用了之后觉得比那个很长的公式容易得多，所以推荐给大家 ）10. 本方法的优点 :不容易污染 ；缺点: .细胞生长周期长，出结果所需时间也长，一般要到第7天才能计算病毒滴度； . 病毒本身有毒性 ，所以对细胞的贴壁造成一定影响 ，这也是此法中细胞生长慢的原因之一 ； .不容易控制细胞数量，需要经验，一旦细胞数量过多，则不到第7天细胞大量死亡，无法判断CPE;若细胞数 量过少 ，则细胞无法正常生长 ，不能正常增殖 ，也是造成无法判断 CPE 的原因之一 ；还有另外一种方法 ，明天再写 .如果有什么不恰当的地方 ，希望有经验的高手多多指教 ，希望大家能多多交流 ，谢谢 !4.维持液 ，即病毒培养液 ，配方为 : .MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3; .MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+N