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1、原位杂交技术课件 原原 位位 杂杂 交交 技技 术术 2012-12-06 原位杂交技术课件 原 位 杂 交 技 术 原位杂交技术的历史发展 二 原位杂交技术的原理及分类 三 原位杂交技术的一般过程 四 原位杂交技术的应用 原位杂交技术课件 一、原位杂交技术的历史发展 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是分子生物学、 组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪 60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等首先用爪蟾核糖体基因 探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时 BuongiornoNardelli和Amaldi等(1970)相继利用同

2、位素标记 核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交 技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20 世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建 成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。 原位杂交技术课件 二、原位杂交技术的原理及分类 概念： 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是用 标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系， 在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位 和相对定量研究的一种手段。 原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将 有放射性或非放射性的外源核酸(即 探针)与组织、细胞或染色体上待

3、测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。 原位杂交技术课件 分类 1、 基因组原位杂交技术 基因组原位杂交(GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交 技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA 以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。 2、荧光原位杂交技术 荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性 原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放 射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记 的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切 片上的特异fl-N：行杂交，通过

4、荧光检测系 统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或 DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂 交位点。 原位杂交技术课件 3 、多彩色荧光原位杂交技术多彩色荧光原位杂交技术 多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧 光原位杂交技术的基础上发展起来的 一种新技术，它用几种不同颜色的荧 光素单独或混合标记的探针进行原位 杂交，能同时检测多个靶位，各靶位 在荧光显微镜下和照片上的颜色不同， 呈现多种色彩。 4、原位原位PCRPCR 原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR 技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增 加，然后通过原位杂交技术

5、进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定 位和定量分析。 原位杂交技术课件 三、原位杂交技术的一般过程 以经过标记的已知核酸分子为探针 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交 再对其探测 原位杂交技术课件 探针探针 标记标记 靶核酸靶核酸 分子分子 杂交杂交 检测检测 原位杂交技术课件 一）、探针 是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片 段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或 RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已 知的，只能与特定的核酸分子结合上 1、cDNA 2、RNA 3、寡核苷酸 原位杂交技术课件 1、cDNA (c

6、omplementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对） 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 较稳定，不易被降解 标记方法可靠易行 优点 原位杂交技术课件 优点： 杂交效率比DNA探针高 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体 比DNA-mRNA杂交体稳定 可以同时得到同义RNA链和反义RNA链 缺点： 2、RNA RNA是单链分子 （探针长度50-300碱基对） 原位杂交技术课件 这类探针是根据靶分子而设计序列 在DNA合成仪上用化学方法合成 优点：形成杂交体快速 （序列短链，杂交时易于穿透） 缺点：特异性较低（短链和简单） 短链探针 (长度10-

7、50个核苷酸) 3、寡核苷酸 原位杂交技术课件 二）、探针标记 1、标记物 （1）放射性标记物 （2）非放射性标记物 2、标记方法 （1）DNA探针标记 （2）RNA探针标记 （3）寡核苷酸探针标记 原位杂交技术课件 1、标记物 高度灵敏性；高度灵敏性； 标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与 模板的结合能力及结合的特异性；模板的结合能力及结合的特异性； 当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（KmKm值）无值）无 多大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；多大影响，以保证标记反应的效率和标记产物

8、的比活性； 高度特异性；高度特异性； 较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简 单；单； 对环境无污染，对人体无损伤；对环境无污染，对人体无损伤； 价格低廉等。价格低廉等。 原位杂交技术课件 放射性标记物：同位素 5 5S S、 、33 33P P、 、32 32P P 和和 3 3H H等等 非放射性标记物：荧光素荧光素 生物素生物素 地高辛地高辛 溴脱氧尿嘧啶等溴脱氧尿嘧啶等 某种单核苷酸某种单核苷酸 在单核苷酸分子中导入某个原子、在单核苷酸分子中导入某个原子、 功能基团或侧链分子作为标记物，功能基团或侧链分子作为标记物， 对碱基配对不造

9、成影响对碱基配对不造成影响 原位杂交技术课件 35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP 32P-UTP 32P-dATP等等 等等 四甲基罗达明四甲基罗达明-UTP 生物素生物素-UTP (Bio-UTP) 地高辛地高辛-dUTP (Dig-dUTP) 溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子 原位杂交技术课件 2、标记方法 （1）DNADNA探针标记探针标记 切口移位法切口移位法 随机引物法随机引物法 （2）RNARNA探针标记探针标记 在体外转录技术中与探针制备同时完成在体外转录技术中与探针制备同时完成 （3）寡核苷酸探针标记寡核苷酸探针标记 末端转移法末端转移法 原

10、位杂交技术课件 切口平移法 原位杂交技术课件 随机引物法 原位杂交技术课件 三）、靶核酸分子 或靶序列）：或靶序列）： 指所要探测的核酸分子或核苷酸序列指所要探测的核酸分子或核苷酸序列 （DNA 或或RNA） 可以是中期染色体上的或是间期细可以是中期染色体上的或是间期细 胞核内的，也可以是线粒体胞核内的，也可以是线粒体DNA或或 病毒病毒DNA 可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子 的的mRNA，也可以是核糖体，也可以是核糖体rRNA 线粒体或病毒线粒体或病毒RNA 原位杂交技术课件 四）、杂交 原位杂交技术课件 1、杂交体 hybrids 原位杂交技术课件 D

11、NA-DNA 杂交双链分子杂交双链分子 原位杂交技术课件 2、杂交条件 （1 1）杂交液）杂交液 （2 2）探针浓度（）探针浓度（3 3）温度（）温度（4 4）pH pH （5 5）时间）时间 （1 1）、杂交液）、杂交液 钠盐（杂交效率钠盐（杂交效率 非特异反应非特异反应） 甲酰胺（使杂交所需温度降低）甲酰胺（使杂交所需温度降低） 硫酸葡聚糖（提高探针浓度）硫酸葡聚糖（提高探针浓度） 牛血清白蛋白和载体牛血清白蛋白和载体DNADNA等等 （阻断探针与组织非特异结合，（阻断探针与组织非特异结合， 背景）背景） 原位杂交技术课件 杂交条件 （2）、探针浓度 探针浓度影响杂交反应的速度 放射性标记

12、探针0.5g/ml 非放射性为2g/ml 最适宜的探针浓度要经实验摸索得到确定 （1 1）杂交液）杂交液 （2 2）探针浓度（）探针浓度（3 3）温度（）温度（4 4）pH pH （5 5）时间）时间 原位杂交技术课件 杂交条件 （3）、温度 杂交时温度一般低于相应杂交体的杂交时温度一般低于相应杂交体的TmTm值值2525 TmTm值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度）值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度） 当杂交液含当杂交液含50%50%甲酰胺、盐浓度甲酰胺、盐浓度0.75mol/L0.75mol/L左右时左右时 杂交温度：杂交温度： 对对DNADNA探针是探针是42

13、42 对对RNARNA探针是探针是50-5550-55 对寡核苷酸探针是对寡核苷酸探针是3737 1）杂交液）杂交液 （2）探针浓度（）探针浓度（3）温度（）温度（4）pH （5）时间）时间 原位杂交技术课件 杂交条件 （4 4）、）、PHPH pH在在5-9范围内，杂交体形成不受影响范围内，杂交体形成不受影响 常用缓冲液常用缓冲液pH为为6.5-7.5 （5 5）、时间）、时间 一般探针浓度下，杂交反应在一般探针浓度下，杂交反应在4-64-6小时小时内完成内完成 孵育孵育6 6小时后小时后 - - 杂交信号不再增强杂交信号不再增强 反应超过反应超过2424小时后小时后 - - 已形成的杂交体

14、可能发生解已形成的杂交体可能发生解 链，杂交信号反而减弱链，杂交信号反而减弱 （1 1）杂交液）杂交液 （2 2）探针浓度（）探针浓度（3 3）温度（）温度（4 4）pH pH （5 5）时间）时间 原位杂交技术课件 3、严格度 在某些条件下，探针可以与含不相配碱基的核在某些条件下，探针可以与含不相配碱基的核 酸序列结合而形成不稳定的杂交体酸序列结合而形成不稳定的杂交体 高严格度条件下高严格度条件下 碱基完全互补的双链可形成碱基完全互补的双链可形成 杂交体杂交体 低严格度条件下低严格度条件下 碱基对不完全互补的双链也碱基对不完全互补的双链也 能形成杂交体能形成杂交体 严格度（严格度（strin

15、gencystringency） 决定探针是否与含不相配碱基的决定探针是否与含不相配碱基的 核酸序列结合的条件称为严格度核酸序列结合的条件称为严格度 原位杂交技术课件 五）、杂交体的探测 使标记的杂交体在光镜或电镜下可见使标记的杂交体在光镜或电镜下可见 （一）（一） 放射自显影方法放射自显影方法 （二）（二） 免疫细胞化学方免疫细胞化学方法法 原位杂交技术课件 （一）、放射自显影方法 方法：方法： 切片上涂覆核子乳胶膜切片上涂覆核子乳胶膜 置于暗盒中于置于暗盒中于44干燥处自显影干燥处自显影 经显影和定影后在显微镜下观察银粒经显影和定影后在显微镜下观察银粒 在细胞和细胞器的分布情况在细胞和细胞

16、器的分布情况 用同位素标记探针来显示杂交反应的方法用同位素标记探针来显示杂交反应的方法 原位杂交技术课件 原位杂交技术课件 （二）、免疫细胞化学方法 报告分子（报告分子（ reportermolecules） 在杂交后探测技术中，为显在杂交后探测技术中，为显 示探针标记物而使用的示探针标记物而使用的免疫细胞免疫细胞 化学标记物化学标记物常被叫做报告分子常被叫做报告分子 即与抗体即与抗体（或亲和素、（或亲和素、 A蛋白、）联结，最终在蛋白、）联结，最终在 显微镜下可见的分子：显微镜下可见的分子： 荧光素荧光素 胶体金胶体金 酶酶-过氧化物酶过氧化物酶-H2O2和和DAB 碱性磷酸酶碱性磷酸酶-NBT/BCIP 用地高辛标记的探针用荧光素、胶体金、酶标记抗地高辛抗体来显 用地高辛标