几种常用生物活性测试方法简介

1、几种常用生物活性几种常用生物活性 测试方法简介测试方法简介 2 总结总结 3 分子水平活性测试分子水平活性测试方法方法 1 CONTENTS 细胞水平活性测试方法细胞水平活性测试方法 等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种 研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量 量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损 伤地同时提供热力学和动力学信息。 Isothermal Titration Calorimetry (ITC) 基本原理基本原理： Q = Ho x V x H

2、.G = Ho x V x x Ho Ka G 1+Ka G Go = -RT ln K a Go = Ho - TSo 注：H 为受体（主体），G为配体（客体），Ka为结合常数 Go为Gibbs自由能变化，Ho 为焓变，So 为熵变 受体-配体复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池 始终保持在实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注 射一次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏 移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。 ITC仪仪结构结构示意图示意图 Isothermal Titration Calori

3、metry (ITC) ITC是一种热量连续变化的量热器。主 要由隔热夹套包裹着的样品池(反应池) 和参比池、注射器和一台计算机组成， 注射器同时具有搅拌作用，计算机控 制温度控制装置和信息反馈系统。 Methods In Cell Biology, 2008, 84,79. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC数据图数据图 Journal of Molecular Recognition.2008, 21, 289. 左图： 横坐标：时间 纵坐标：热功率 峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。 右图： 横坐标：滴定物与样品溶液的

4、摩尔比 纵坐标：滴定产生的总热量 反应过程的结合等温曲线 ITC独特之处： 样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最 小用量0.4ug，滴定池体积1.43 ml 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。 操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注 射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由软件分析ITC得到的数据。 量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。 ITC的用途： 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数(Ka)、结合位点数(n)、摩 尔结合焓(H）、摩尔结合熵（

5、 S）、摩尔恒压热容（ Cp），和动力学参数 (如酶活力（Kcat）、酶促反应米氏常数(Km) 。 可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、 酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋 白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞 相互作用等方面。 Isothermal Titration Calorimetry (ITC) surface plasmon resonance , SPR 表面等离子表面等离子共振（共振（SPR）原理）原理 消逝波消逝波：当入射光到达界面时并不是直 接产生

6、反射光，而是先透过光疏介质约 一个波长的深度，再沿界面流动约半个 波长再返回光密介质，透过光疏介质的 波被称为消逝波。 等离子波等离子波：当金属受电磁干扰时，金属内部 的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力 的存在，电子不会在引力与斥力的平衡位置 停下而向前运动一段距离，之后电子间存在 的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开 该区域。由此会形成一种整个电子系统的集 体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡 反复进行震荡，并以波的形式表现。 surface plasmon resonance , SPR 表面等离子表面等离子共振原理共振原理 光在棱镜与金属膜表面上发生全反射 现象时，会形成消逝波进

7、入到光疏介 质中与介质中存在一定的等离子波相 遇时可能会发生共振。当消逝波与表 面等离子波发生共振时，检测到的反 射光强会大幅度地减弱。 SPR角：反射光完全消失的角。 SPR角随金属表面折射率变化而变化， 而折射率的变化又与金属表面结合的 分子质量成正比。 可通过 SPR 角的变化捕获生物反应过 程中生物分子之间相互作用的特异信 号，对待测物质进行测定直接测量反 应平衡常数 Ka，解离平衡常数 Kd 等。 surface plasmon resonance , SPR 将待测分子键合在生物传感芯片表面，使其形成分子敏感膜， 再将分析物分子溶液 注入，使其以恒定流速流过芯片表面，如果两者通过相

8、互作用而结合，则将引起生 物传感器表面质量的增加， 导致传感器表面折射率的变化，从而引起SPR角的改变。 SPR被广泛应用于分析生物分子如蛋白质-蛋白质、药物-蛋白质、蛋白质-核酸、核 酸-核酸之间的相互作用，所涉及的研究领域包括免疫学、蛋白质组学及药物筛选等。 J.Pharmaceut.Biomedical.2008,11,28. surface plasmon resonance , SPR SPR的优点：的优点： p 可以实时、连续监测反应的动态过程， 灵敏度较高 。 p 可实时记录反应的结合与解离过程。 p 每次检测结束后，结合在金属膜芯片 上的反应物可以用洗脱液洗脱使芯片 再生，可重

9、复使用，节约耗材。 p 可以得到高通量数据。 SPR的缺点：的缺点： p 待测物在金属薄膜表面的固定：由于生物大分子本身理化性质的复杂性，空间 结构的特殊性，偶联结果可能导致偶联物特异作用位点的失活。 p 分析物在金属薄膜表面的结合：难以区分非特异性结合，若分析物在芯片表面 是非特异性结合， 会给整个实验带来干扰，造成错误的结论。 p 待测物的分子大小：适用于生物大分子，小分子的质量变化对折射率变化不明 显， 因此会给小分子待测物的检测造成困难。 p 动态范围过小：对温度、样品组成、金属薄膜要求高。 分子水平活性测试方法 特点特点SPRITC 固定化需要不需要 结果动力学动力学和热力学 得到数

10、据Ka, KdKa,，H、 Cp 运行时间210min3060min 分子质量1000无限制 样品量约1mg最小含量0.4ug 温度1540280 溶剂非强有机溶剂无限制 耗材芯片试剂 药物筛选适用不适用 SPR 与与 ITC 功能特性功能特性对比对比 Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) FRET原理原理 传统FRET技术容易受样品组分(缓冲液，蛋白， 化学物质及细胞裂解产物等)背景荧光信号的 影响。 时间分辨通过去除寿命较短的背景，分辨目的 荧光。 通过使用供体和受体荧光团标记， TR-FRET 检测将时间分辨 (TR)

11、和 荧光共振能量转移 (FRET) 原理的 优势结合到了一起。 J. Biomol. Screen. 2015, 7,4. 镧系元素（铕Eu 和铽Tb）半衰期 长(us-ms)，将Eu 纳入立体笼中， 形成稳固复合体， 笼收集光将能量 转移到Eu上。 p Eu永久性嵌合穴状口袋（非螯合作用） 耐受性好，对温度，光强，PH，离子 强度变化影响较小。不易受化学物质 干扰，如EDTA，二价离子（Mg2+， Mn2+）等。 p 持续激活后没有光漂白现象,可以多次 读数，从而进行动力学实验。 p 镧系元素的半衰期大于1毫秒，与普 通荧光纳秒级的半衰期相差6个数量 级。当延迟50微秒读数时，普通荧光 的信

12、号近似于零。检测的发射光中没 有来自于激发波长的干扰。 J. Phys. Chem. C, 2008. 17, 112. 铕穴状化合物的激发和发射光谱铕穴状化合物的激发和发射光谱 Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) Stokes shift 300nm Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) Donor ExcitationE mission (nm) Acceptor ExcitationE mission (nm) Stokes Shift (nm)(do

13、nor excitation acceptor emission) Europium3+340615Allophycocyanin（APC）615660320 Terbium3+340545Phycoerythrin（Phy）545575235 J. Phys. Chem. C. 2013,112,6589. When these two fluorophores are brought together by a biomolecular interaction, a portion of the energy captured by the Europium during excitati

14、on is released through fluorescence emission at 620 nm, while the remaining energy is transferred to the APC. This energy is then released by APC as specific fluorescence at 660 nm only via FRET with Europium. General Format For FRET Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) J. Biomol. Sc

15、reen. 2015, 7,4. PD1-PDL1 binding assay 1.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer分别将成分Eu-labeled donor 和 dye-labeled acceptor (带带straptavidin标记）标记） 100倍稀释； 2.向384孔板中，每孔加入稀释好的Eu-labeled donor 和dye-labeled acceptor 各2.5ul； 3.向每孔中加入一定量的化合物，阳性对照组加入对应体积的DMSO；振荡反应 1min； 4 .根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分

16、BET Bromodomain 40倍稀释。 分别向化合物检测组和阳性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 5.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分acetylated Ligand1（带（带Biotin 标记）标记） 40倍稀释。向阴性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 6. 每孔加入一定量的BRD4 bromodomain ，保证每个反应体系中含有4.5ng含量的酶。 7 .室温静置反应1h后，测值340/665nm。 Time-resolved fluorescence energy tr

17、ansfer (TR-FRET) BDR4相关相关化合物化合物TR-FRET活性测试方法活性测试方法 BRD4(BD1)TR-FRET Assay Kit 购买自 BPS Bioscience 公司 (620/670nmCayman enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 可用于测定抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤不同，有以下 几种类型： p 直接法 p 间接法 p 双抗体夹心法 p 竞争法 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 基本原理是先将已知的抗体或抗原

18、结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。 测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体 或抗原发生反应。 用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显 色，进行定性或定量测定。 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 直接法直接法（Direct ELISA） 间接法（间接法（Indirect ELISA） 将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本 (含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标 抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。 检测抗体最常用的方法。 双抗夹心法（双抗夹心法（Sandwich ELISA

19、） enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 将已知抗体吸附于固相载体加 入待检标本(含相应抗原)与之结 合。温育后洗涤，加入酶标抗体 和底物进行测定。 （竞争法（竞争法Competitive ELISA） 可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于 测定抗体。 以测定抗原为例将持异性抗体吸附于固 相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知 抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗 涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测 抗原含量呈负相关。 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 在ELISA法中，底物被酶裂解后，能生成可

20、溶性有色产物，适合用分光光度计 (酶标仪)测量光密度值，以定量测定样品中待测抗原或抗体的含量。 ELISA常用常用的酶及其底物的酶及其底物 酶来源底物/供氢体呈色测量方法 辣根过氧化物酶 （HRP） 辣根 H2O2 /四甲基联苯胺 （TMB） 蓝色450 nm H2O2 /邻苯二胺 （OPD） 橙色490 nm 碱性磷酸酶 （AP） 小牛肠粘膜 大肠杆菌 对硝基苯磷酸盐 （PNP） 黄色405 nm H2O2 + Donor 2 H2O + Oxidized donor HRP/AP 1. Integrin 61蛋白 5g/ml，50l/孔，4C固定过夜；（包被（包被 Coating） 2.

21、PBS 250l/孔 冲洗3次；（封闭（封闭 Blocking） 3. 加入上述多肽，其中CRWY-biotin 工作浓度为0.00005mol/L，体积为 50l。阻断肽为0.0005mol/L，50l； 4. 室温结合1小时； 5. HEPES冲洗6次，250l/次； 6. 加入HRP- straptavidin 1：3000，室温1小时； 7. HEPES冲洗6次，250l/次； 8. 加入50l TMB，观察显色效果； 9. 加入100l 0.5M H2SO4终止反应，450nm测OD值。 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) ELISA测试

22、测试CRWY修饰肽与整合素修饰肽与整合素6的的亲和力实验方法亲和力实验方法 竞争法竞争法 BAS-ELISA 2 总结总结 3 分子水平活性测试分子水平活性测试方法方法 1 CONTENTS 细胞水平活性测试方法细胞水平活性测试方法 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝 紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细 胞中的甲瓒，用酶标仪在540 或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细 胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。用于检测细 胞增殖、细胞毒性。 MTT是一种粉末状化学试剂，全称为

23、3- (4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，化学名为 3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐。 商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。 MTT MTT 1.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，,加入浓度梯度的药物, 一般5-7个梯 度,每孔100ul,设3-5个复孔。 2.5%CO2，37孵育16-48小时。 3.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。 4.终止培养，准备溶解结晶，测试吸光度。 第一种，DMSO溶解 MTT加入培养4h后，结晶可充分形成

24、，将细胞上清去掉。 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。 酶标仪测OD 570nm处测量各孔的吸光值。 第二种：三联溶解液 该方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（溶解液因含 有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至 室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。） 放入培养箱中继续孵育46小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸 光度。 MTT一般操作方法一般操作方法 MTT的缺点：的缺点： 由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。不仅使 工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响。

25、MTT有致癌性。 MTT对菌很敏感，配成的MTT需要无菌保存。 可靠度和灵敏度易受细胞容积、氧化还原剂、有色物质等因素干扰。 MTT MTT的优点：的优点： 不涉及使用同位素； 使用试剂少，仪器简单，耗时少； 线性范围宽； 适用于大量抗癌药物的筛选。 Cell Counting Kit-8（CCK-8） 基本原理基本原理：该试剂中含有WST-8【化学名：2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二 磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲 氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被活细胞中的脱氢酶还原为具 有高度水溶性的黄色甲瓒

26、产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成 正比。 CCK8的优点的优点： 使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； CCK-8法能快速检测； CCK-8法的检测灵敏度很高，可以测定较低细胞密度； CCK-8法的重复性优于MTT 法； CCK-8法对细胞毒性小； CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。 Cell Counting Kit-8（CCK-8） CCK8的缺点的缺点： p 与MTT法相 比，CCK8的价格比较贵。 p CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏 加或多加。 1、各种癌细胞系

27、按适宜的细胞浓度，50uL/孔体积铺板384孔板， 37培养过夜， 处理。 2、化合物稀释: 先将化合物用DMSO溶解成10mM储存液，并用DMSO 3倍梯度稀 释成10个浓度梯度，成1000化合物系列浓度储存液，再转移至化合物转移仪器 适配384 PP板中备用。 3、利用化合物转移仪器Liquid Handler Echo520将1000系列浓度化合物转移至癌 细胞384孔板的相应孔中，每孔50nL，空白对照孔加入50nL DMSO。轻柔混匀， 37继续培养。 4、72小时后加入CCK8细胞增殖毒性检测试剂，3uL/孔，37孵育2小时。然后 用酶标仪检测450nm光吸收强度。 Cell Co

28、unting Kit-8（CCK-8） BDR4相关化合物抗癌细胞活性体外筛选方法相关化合物抗癌细胞活性体外筛选方法 检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法 甲臢产物的水溶性 差（需加有机溶 剂溶解） 好好好 产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液 使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用 检测灵敏度高很高很高高 检测时间较长较短较短最短 检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm 细胞毒性高，细胞形态完 全消失 很低，细胞形态 不变 很低，细胞形态 不变 很低，细胞形态 不变 试剂稳定性一般较差一般很好 批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合 便捷程度一般便捷便捷非常便捷 细胞水平活性测试方法 检测细胞增殖检测细胞增殖/ /毒性测试方法比较毒性测试方法比较 Sulforhodamine B（SRB） SRB（即磺酰罗丹明B， Sulforhodamine