高效液相色谱方法及应用

1、1 高效液相色谱方法 及应用 2 主要内容 1.绪论 2.高效液相色谱法的特点 3.高效液相色谱法的分类 4.化学键合相色谱 5.高效液相色谱仪 6.定性、定量分析基本原理 7.在药物分析中的应用 3 高效液相色谱法高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatography HPLC） 是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高 压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例 的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱 柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测， 从而实现对试样的分析。 4 v经典液相色谱法为基础 v引入气相色谱法的理论和实验技术

2、 v高压输送流动相 v高效固定相及高灵敏度检测器 v现代液相色谱分析方法 5 “三高一广一快三高一广一快” 高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻 力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液 加高压，一般可达150350105Pa 。 高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达 到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的 分离效能高出许多倍。 高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng/ml，进样量在 uL数量级。 6 “三高一广一快三高一广一快” 应用范围广：80%以上的有机化合物可用HPLC分析， 特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合 物的分离分析，显示出优势。 分析速度快、载液流速快：

3、通常分析一个样品仅需几 分钟到几十分钟的时间，一般小于1小时。 色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点 7 局限性：局限性： v使用多种溶剂作为流动相，成本高于气相色谱法，且易 引起环境污染，梯度洗脱操作复杂； v “柱外效应” ：在从进样到检测器之间，除了柱子以外 的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等） 中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散 和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低； v高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱； v不能代替中、低压柱色谱法，在200KPa至1MPa柱压下 去分析受压易分解、变性的具有生物活性的生化样品。 8 1经典LC：仅做为一

4、种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不 均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长 无法在线检测 9 2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀 浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H，n） 分析时间大大缩短 可以在线检测 10 HPLC与与GC差别差别 相同：兼具分离和分析功能 均可以在线检测 不同： 1分析对象的区别 2流动相的区别 3操作条件区别 11 HPLC与与GC差别差别 1分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但 对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测，占有机物的2

5、0% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、 难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均 可检测，用途广泛，占有机物的80% 12 HPLC与与GC差别差别 2流动相的区别 GC：流动相为惰性气体，气体组分与流动相无亲合作 用力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力， 能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。 且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH 值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两 种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 13 HPLC与与GC

6、差别差别 3操作条件区别 GC：加温操作 HPLC：室温，高压（液体粘度大，峰展宽小） 14 HPLC的分类的分类 根据分离机制不同分为根据分离机制不同分为: 1、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography) 2、液液分配色谱法（LLC） (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography ) 3、离子色谱法（IC） ( ion-exchange chromatography and ion pair chromatography

7、) 4、空间排阻色谱法（SEC） ( steric exclusion chromatography ) 15 其他色谱类型其他色谱类型： v亲和色谱（Affinity Chromatography; AC） v手性色谱法（Chiral Chromatography；CC） v胶束色谱法（Micellar Chromatography；MC） v电色谱法（Electrochromatography；EC） 16 液液固色谱法固色谱法 v固定相：固体吸附剂（如硅胶、氧化铝等，粒度 510m） v流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂 v基本原理：溶质分子占据固定相表面吸附活性中 心能力的差异；分离

8、过程是一个吸附-解吸附的平 衡过程 17 液液固色谱法固色谱法 v适用范围：适用于分离相对分子质量中等的油溶 性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高 选择性 v缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾 18 液液液分配色谱法液分配色谱法 固定相与流动相：均为液体（互不相溶），其中固 定相是将特殊的液态物质涂于或化学键合于担体 表面，常用的载体材料为全多孔型或薄壳型（表 面多孔）微粒硅胶吸附剂 基本原理：根据被分离组分在固定相和流动相中溶 解度不同而分离，分离过程是一个分配平衡过程 适用范围：水溶性和油溶性样品，极性和非极性化 合物，离子型和非离子型化合物等 19 液液液分配色谱法液分配色谱法 优

9、点：色谱柱再生方便，样品负载量大，重现性好， 分离效果好等 缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同， 但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过 色谱柱时的机械冲击力，造成固定液流失。上世 纪70年代末发展的化学键合固定相可克服上述缺 点。现在应用很广泛（7080%）。 20 化学键合相色谱化学键合相色谱 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱 法 (bonded phase chromatography；BPC) 化学键合固定相：采用化学反应的方法将官能团键 合在载体表面所形成的固定相 正相（正相（normal phasenormal phase，NPNP）和反相（）和反相（rev

10、ersed phasereversed phase，RPRP）键合相色谱法）键合相色谱法 21 正相键合相色谱正相键合相色谱 流动相的极性小于固定液的极性 分离机制：分配：把有机键合层作为一个液膜看 待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质分子与固定相之间定向作 用力、诱导力或氢作用力 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 流动相：相对极性小的疏水性溶剂（烷烃类如正 己烷、环己烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢 呋喃、二氯甲烷等以调节组分的保留时间 22 正相键合相色谱正相键合相色谱 出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极 性大的组分后出柱 适用范围：中等极性和极性较强的化合物（如酚类、 胺类、羰基类及

11、氨基酸类等） 23 反相键合相色谱反相键合相色谱 流动相的极性大于固定液的极性 分离机制：疏溶剂理论-溶质的保留主要是溶质 分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分 子与键合相的烃基发生疏水缔合。 排斥力强，作用时间，k，组分tR 排斥力弱，作用时间，k，组分tR 固定相：极性小的烷基键合相（如C8柱，C18柱） 24 反相键合相色谱反相键合相色谱 流动相：水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙 醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以 调节保留时间 出柱顺序：极性大的组分先出柱，极性小的组分 后出柱 适用范围：非极性和极性较弱的化合物，占整个 HPLC应用的80%左右 25 化学键合色谱具有下列

12、优点：化学键合色谱具有下列优点： 1、适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应， 可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选 择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非 极性、极性和离子型化合物。 2、由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定 液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创 造了条件。 3、键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和 热稳定性。 4、固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。 26 高效液相色谱仪 组成组成 v输液系统 v进样器 v色谱柱 v检测器 v组分收集

13、器 v数据获取与处理系统 27 进样器进样器 停留进样装置、手动进样阀（六通阀）、 自动进样装置 28 检测器检测器 示差折光化学检测器 紫外吸收检测器 紫外一可同分光光度检测器 二极管阵列紫外检测器 荧光检测器 电化学检测器 29 专属型检测器 它对不同组成的物质响应差别极大，因此只能选 择性的检测某些物质，如紫外检测器、荧光检测 器和电导检测器。 通用型检测器 它对大多数物质的响应相差不大几乎适用于所有 物质，如示差折光化学检测器 。但它的灵敏度低， 受温度影响波动大、使用时有一定局限性。 30 紫外吸收检测器 简称紫外检测器（ ultraviolet absorption detecto

14、r ， UV），是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测 器。 因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外 吸收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的检 测器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。 它不仅有较好的选择性和较高的灵敏度，而且对环境温 度、流动相组成变化和流速波动不太敏感，因此既可用 于等度洗脱，也可用于梯度洗脱。 31 检测原理： 朗伯比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号（吸光 度）与浓度成正比A=Cl 特点： 灵敏度较高（10-6-10-9 g/ml），噪音低，线性范围宽， 稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品，应用广（如 蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多

15、肽、激素等均可 使用 ） 局限： 只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小 于检测波长 专属型、浓度型检测器 32 示差折光检测器示差折光检测器 v凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折 光检测器检测 v糖类化合物的检测大多使用此检测系统 v这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为 10-7gml） v流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于 痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测 33 荧光检测器荧光检测器 v凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强 度与物质的浓度成正比 v只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、 胺类、维生素和某些蛋

16、白质等）的测定 柱前或柱后衍生 v其灵敏度很高（检测下限为10-1210-14gml） v痕量分析和梯度洗脱样品的检测均可采用 34 从色谱流出曲线中可以得出许多重要信息：从色谱流出曲线中可以得出许多重要信息： 样品所含组分的最少个数； 定性分析（保留值）； 定量分析（峰高或面积）； 分离效能（保留值及区域宽度）； 两相选择的依据（峰间距离） 35 HPLC定性分析的基本原理定性分析的基本原理 在同一个色谱条件下，不同样品内所含有的同一物 质，在色谱柱内具有相同的作用机理和平衡参数， 因此，具有相同的色谱保留行为，反映在色谱图上 就是有相同的保留时间，这就是高效液相色谱仪定 性的依据。 36

17、但是，由于色谱柱内，被分析物质和固定相、流 动相之间作用的复杂性，以及色谱柱的分离能力- 柱效的局限，有些物质是不能分离或是完全分开， 因此出现在同一或是相近的保留时间内。色谱的这 种定性的局限性概括为：在同一色谱条件下，同一 物质具有相同的保留时间，而同一保留时间并不说 明是同一物质。 37 为提高高效液相色谱的定性能力，通常使用一些具 有较强定性能力的检测器，如：液相色谱-质谱联用 仪（LC-MS）,液相色谱-紫外可见光扫描检测器 （HPLC-PDA），液相色谱-红外、核磁联用仪等。 通过这些检测器可对每一组分进行定性分析。 38 定量分析的基本原理定量分析的基本原理 当一个样品在色谱柱内

18、被分离成几个组分以后，每 个组分依次流经检测器，经检测得到相应的色谱图。 色谱图中各个组分的响应值，也就是色谱峰的一些 性质如峰高、峰面积是定量分析的基本依据。 39 以常用的紫外-可见光检测器为例：由于紫外-可见 光检测器(UV-Vis检测器)与分光光度计的基本原理 一致，在一定的浓度范围内都服从比尔定律 （Beers law）: a=ebc 其中，a：吸光度；e：该物质的摩尔吸光系数；b： 光程；c：该物质的浓度。 40 在一定的浓度范围内，有 C=kA+b C：样品中该物质的浓度，A:该物质对应的峰面积， k、b为常数。 也就是说，被分析样品内某一物质的浓度和该物质 所对应的峰面积成正比

19、，这就是高效液相色谱定量 分析的基本原理。 41 在药物分析中的应用 1.在鉴别中的应用在鉴别中的应用 在HPLC法中，保留时间与组分的结构和性质有关，是定性 的参数，可用于药物的鉴别。如中国药典收载的药物头孢羟 氨苄的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供 试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。头抱 拉定、头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液、曲安奈 德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别。 42 2.在杂质检查中的应用在杂质检查中的应用 HPLC分离效能高，灵敏，在药物的杂质检查中应用广泛。 主要用于药物中有关物质的检查。 “有关物质有关物质”是指药物中存在的合成原

20、料、中间体、副产物、降解产物 等物质，这些物质的结构和性质与药物相似，含量很低，只有采用色 谱的方法才能将其分离并检测。 若杂质是已知的，又有杂质的对照品，可用杂质对照品做 对照进行检查。若杂质是未知的，可以采用主成分自身对 照法或峰面积归一化法进行检查。 43 3在含量测定中的应用在含量测定中的应用 用高效液相色谱法测定含量可以消除药物中的杂质，制 剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰。中药材及其 制剂组成复杂，基中不少有效成分的含量测定也越来越 多地采用了高效液相色谱法。 4.手性分离手性分离 44 5.在血药浓度检测中的应用在血药浓度检测中的应用 用HPLC测定可疑中毒病人血中药物浓度具有准确、快速 的优点，可