生物化学与分子生物学实验(终版)

1、生物化学实验技术生物化学实验技术 生物技术专业实验室生物技术专业实验室 王小英王小英 实验内容实验内容 v生物化学实验基本操作生物化学实验基本操作 v实验一实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量 v实验二实验二 血清丙氨酸氨基转移酶的测定血清丙氨酸氨基转移酶的测定 1 1、掌握刻度吸量管及分光光度计的使用方法。、掌握刻度吸量管及分光光度计的使用方法。 2 2、掌握分光光度法测定物质含量的方法。、掌握分光光度法测定物质含量的方法。 3 3、熟悉实验室规则，实验报告的书写要求。、熟悉实验室规则，实验报告的书写要求。 4 4、了解分光光度法的基本原理和溶液的混匀方法。、了解分光

2、光度法的基本原理和溶液的混匀方法。 一、一、 实验目的实验目的 生物化学实验基本操作生物化学实验基本操作 v实验前必须认真预习。不旷课、不迟到、不早退。实验前必须认真预习。不旷课、不迟到、不早退。 v进入实验室要穿白大衣，严禁穿拖鞋进实验室，严禁进入实验室要穿白大衣，严禁穿拖鞋进实验室，严禁 实验室内进食。实验室内进食。 v自觉遵守实验室纪律，保持实验室安静。不要随意走自觉遵守实验室纪律，保持实验室安静。不要随意走 动和摆弄与本次实验无关的仪器和物品。动和摆弄与本次实验无关的仪器和物品。 v认真按照实验步骤和操作规程进行。详细记录实验数认真按照实验步骤和操作规程进行。详细记录实验数 据，实验完

3、毕及时整理实验数据，并提交实验报告。据，实验完毕及时整理实验数据，并提交实验报告。 （一）实验室规则（一）实验室规则 v要爱护仪器，使用贵重精密仪器应严格遵守操作要爱护仪器，使用贵重精密仪器应严格遵守操作 规程。实验完毕及时在仪器记录本上登记，如仪规程。实验完毕及时在仪器记录本上登记，如仪 器发生故障应立即报告指导老师，未经许可不得器发生故障应立即报告指导老师，未经许可不得 自己随意检修。自己随意检修。 v实验完毕后，个人必须整理自己的实验台面。值实验完毕后，个人必须整理自己的实验台面。值 日生负责做好实验室的卫生，检查并关好水、电、日生负责做好实验室的卫生，检查并关好水、电、 门、窗。门、窗

4、。 （二）实验报告要求及格式（二）实验报告要求及格式 实验实验X X 实验名称实验名称 【实验目的【实验目的】 【实验原理【实验原理】 【实验步骤【实验步骤】 【实验结果【实验结果】 【结果分析与讨论【结果分析与讨论 】 （三）刻度吸管的使用（三）刻度吸管的使用 1、规规 格格：0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、 2.0、5.0、10.0（ml） 2、使用方法使用方法：左手拿球，右手拿管，左手拿球，右手拿管， 食指控制液体量，吸液，吸管稍食指控制液体量，吸液，吸管稍 倾斜，抹管尖后调整液体量。食倾斜，抹管尖后调整液体量。食 指轻轻旋转，放出液体。指轻轻旋转，放出液体。 3、使用注意事项

5、使用注意事项 （1）选管：所用吸管规格最好应稍大于或等于所吸）选管：所用吸管规格最好应稍大于或等于所吸 的液体量。的液体量。 （2）抹管尖：在吸血清、标准液时，应用滤纸抹去）抹管尖：在吸血清、标准液时，应用滤纸抹去 管外多余的液体。管外多余的液体。 （3）吹管：刻度吸量管注明）吹管：刻度吸量管注明“吹吹”字的应吹出残液。字的应吹出残液。 （4）读数：液体弯液面的最低点、刻度线上缘与视）读数：液体弯液面的最低点、刻度线上缘与视 线在同一水平上。线在同一水平上。 （5）洗管：吸血清的吸管，应及时洗清。）洗管：吸血清的吸管，应及时洗清。 （四）溶液的混匀（四）溶液的混匀 v1、指弹法、指弹法 v2、

6、旋转混匀法、旋转混匀法 v3、颠倒混匀法、颠倒混匀法 v4、涡旋振荡器混匀法、涡旋振荡器混匀法 v5、玻棒搅拌混匀法、玻棒搅拌混匀法 （五）分光光度计（五）分光光度计 是运用分光光度法（即比色法）测定物质含量的是运用分光光度法（即比色法）测定物质含量的 一种装置。一种装置。 分光光度法：是根据物质对光的选择性吸收及光分光光度法：是根据物质对光的选择性吸收及光 的吸收定律，对物质进行定性、定量的分析方法。的吸收定律，对物质进行定性、定量的分析方法。 它的理论依据是它的理论依据是Lambert-beer定律定律 （1）透光率（）透光率（T）和吸光度（）和吸光度（A） I0IaIt 用用 表示光线透

7、过溶液的能力，称为透光率表示光线透过溶液的能力，称为透光率 (transmitance, T ) 0 I It 透光率的负对数称为吸光度（透光率的负对数称为吸光度（absorbance, A） 1、分光光度法的原理、分光光度法的原理 t I I 0 lg T 1 lgAlgT （2）光的吸收定律光的吸收定律LambertBeer定律定律 A=KCL 定义：定义：一束单色光通过介质溶液后，光能被吸收一一束单色光通过介质溶液后，光能被吸收一 部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。 A：为吸光度：为吸光度 C：为溶液浓度：为溶液浓度 L：为溶液层厚度：为溶液

8、层厚度 K：为吸光系数：为吸光系数 2、定量分析方法、定量分析方法 （1）标准曲线法）标准曲线法 标准曲线（标准曲线（A-c曲线）曲线） （2）标准对比法（三管法）标准对比法（三管法） A样样K样样c样样L样样 A标标K标标c标标L标标 标 标 样 样 c A A c 同台仪器，相同厚度吸收池及同一波长测定，故同台仪器，相同厚度吸收池及同一波长测定，故 K样 样 K标 标， ，L样 样 L标 标，所以： ，所以： 光的互补示意图光的互补示意图 3、选用何种单色光通过溶液、选用何种单色光通过溶液? v互补色光互补色光 ：两种适当颜色的单色光按一定强度比：两种适当颜色的单色光按一定强度比 例混合可

9、成为白光，这两种单色光称为互补色光例混合可成为白光，这两种单色光称为互补色光 4、分光光度计的基本结构：、分光光度计的基本结构： 光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器 指示器指示器 分光光度计的基本结构图分光光度计的基本结构图 5 5、722722型分光光度计的操作方法型分光光度计的操作方法 v接电源，开开关，预热接电源，开开关，预热3030分钟（打开暗盒）；分钟（打开暗盒）； v选波长，选择开关置于选波长，选择开关置于“T”T”，“调调0”0”点；点； v盛空白，装样品，关暗盒，调盛空白，装样品，关暗盒，调 “ “100%”100%”； v将选择开关置于将选择开关置于“A” A” ，

10、拉动拉杆，记读数；，拉动拉杆，记读数； v取出比色杯，关上暗盒及开关，拔掉电源；取出比色杯，关上暗盒及开关，拔掉电源； 6 6、注意事项、注意事项 （1 1）为了防止光电管疲劳，不测定时必须将比色槽为了防止光电管疲劳，不测定时必须将比色槽 暗箱盖打开，使光路切断，以延长电管使用寿命。暗箱盖打开，使光路切断，以延长电管使用寿命。 （2 2）手拿比色杯粗面，装液量一般占比色杯体积的）手拿比色杯粗面，装液量一般占比色杯体积的 2/32/33/43/4； （3 3）本型仪器）本型仪器A A值在值在0.10.10.80.8之间误差较小，准确度之间误差较小，准确度 较高。较高。 实验一实验一 双缩脲法测定

11、蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量 P135 一、实验目的 v1、掌握双缩脲法测定蛋白质的原理及操作方法、掌握双缩脲法测定蛋白质的原理及操作方法 v2、了解血清总蛋白测定的临床意义、了解血清总蛋白测定的临床意义 二、实验原理 v什么是肽键？什么是肽键？ v什么是双缩脲？什么是双缩脲？ O 2 NH2-C-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 + NH2 尿素尿素双缩脲双缩脲 （-CO-NH-） 双缩脲反应双缩脲反应 三、实验步骤三、实验步骤 1、 “三管法三管法”，取中号试管，取中号试管3支，支，按下表加入试剂：按下表加入试剂： 加入物（加入物（mL） 管号管号 测定管测定管标准管标准管空白

12、管空白管 待测溶液待测溶液0.05 蛋白标准液蛋白标准液0.6 0.9%NaCl2.952.43.0 双缩脲试剂双缩脲试剂3.03.03.0 37保温保温10分钟，分钟，722-分光光度计分光光度计540nm波长以波长以空白管空白管调节零调节零 点比色，记录各管吸光度。点比色，记录各管吸光度。 2、待测溶液蛋白含量计算：、待测溶液蛋白含量计算： 例如，已知蛋白标准液蛋白质含量为例如，已知蛋白标准液蛋白质含量为5mg/mL，则（，则（ 标准管）蛋白含量为标准管）蛋白含量为1mg/mL，计算待测溶液蛋白含，计算待测溶液蛋白含 量为：量为： 标准管吸光度 测定管吸光度 1mg/mL60（稀释倍数）（

13、稀释倍数） = mg/mL 四、注意事项 v血清及标准液取量应准确（刻度吸管的使用血清及标准液取量应准确（刻度吸管的使用 注意事项）。注意事项）。 v须于显色后须于显色后30min内测定。内测定。 五、临床意义 正常成人血清总蛋白含量为：正常成人血清总蛋白含量为：60-80g/L。 v血清总蛋白增高：血清总蛋白增高： （1）血液浓缩，导致总蛋白浓度相对增高；）血液浓缩，导致总蛋白浓度相对增高； （2）血浆蛋白质合成增加：主要见于球蛋白合成增）血浆蛋白质合成增加：主要见于球蛋白合成增 加，如多发性骨髓瘤患者。加，如多发性骨髓瘤患者。 v血清总蛋白降低：血清总蛋白降低： （1）血液稀释，导致总蛋白

14、浓度相对降低；）血液稀释，导致总蛋白浓度相对降低； （2）消耗增加：如甲状腺功能亢进，恶性肿瘤等。）消耗增加：如甲状腺功能亢进，恶性肿瘤等。 （3）蛋白质丢失：如肾病综合征病人大量蛋白从尿）蛋白质丢失：如肾病综合征病人大量蛋白从尿 液中丢失。液中丢失。 六、思考题 v蛋白质测定的方法有哪些？请简述其原理？蛋白质测定的方法有哪些？请简述其原理？ 实验二实验二 血清丙氨酸氨基转移酶血清丙氨酸氨基转移酶 （ALTALT）测定）测定赖氏法赖氏法 P148 一、实验目的一、实验目的 v1、掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的基本、掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的基本 原理及方法。原理及方法。 v2、了解

15、血清丙氨酸氨基转移酶测定的临床意义。、了解血清丙氨酸氨基转移酶测定的临床意义。 ALT测定方法 v 速率法速率法 v 手工法手工法 赖氏法（赖氏法（30min） 金氏法（金氏法（60min） 穆氏法（穆氏法（60min） 三种方法的测定原理、操作、试剂和采用温度等三种方法的测定原理、操作、试剂和采用温度等 方面均完全相同，只是酶与底物反应的时间与正常方面均完全相同，只是酶与底物反应的时间与正常 参考范围不同。参考范围不同。 二、实验原理二、实验原理 丙氨酸丙氨酸 -酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸谷氨酸谷氨酸 1、转氨基作用、转氨基作用 2、显色反应、显色反应 =505nm 加入物加入物(ml)

16、测定空白管测定空白管测定管测定管 血清血清0.10.1 基质缓冲液基质缓冲液0.5 混匀后，置混匀后，置37保温保温30min 2,4二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液0.50.5 基质缓冲液基质缓冲液0.5 混匀后，置混匀后，置37保温保温20min 0.4mol/L NaOH溶液溶液5.05.0 1、测定管及测定空白管的制备、测定管及测定空白管的制备 三、实验步骤三、实验步骤 加入物加入物(ml)试剂空试剂空 白管白管 标准管标准管 0.1mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.10.1 2.0mmol/L丙酮酸标准丙酮酸标准 液液 00.05 基质缓冲液基质缓冲液0.500.45 2,4-二硝基

17、苯肼溶液二硝基苯肼溶液0.50.5 混匀，混匀，37水浴水浴20min 0.4mol/LNaOH溶液溶液5.05.0 2、标准管及试剂空白管的制备、标准管及试剂空白管的制备 3、室温放置、室温放置5min，在波长，在波长505nm处以处以蒸馏水蒸馏水调零，调零， 读取各管吸光度。读取各管吸光度。 四、实验结果四、实验结果 【参考范围】【参考范围】 525卡门氏单位。卡门氏单位。 测定管吸光度测定管吸光度 测定空白管吸光度测定空白管吸光度 标准管吸光度标准管吸光度 试剂空白管吸光度试剂空白管吸光度 = 28（卡门氏单位）（卡门氏单位） 酶活力计算：酶活力计算：不做标准曲线时，可以做不做标准曲线时，可以做28卡门氏单卡门氏单 位的标准管，按下式计算：位的标准管，按下式计算： 五、注意事项五、注意事项 v1、吸血清、标准液的量要准确。、吸血清、标准液的量要准确。 v2、充分混匀使反应充分。、充分混匀使反应充分。 v3、酶促反应的时间要把控好。、酶促反应的时间要把控好。 v4、严重脂血症、黄疸及溶血血清可增加测定的吸、严重脂血症、黄疸及溶血血清可增加测定的吸 光度，应作血清标本对照管光度，应作血清标本对照管 六、临床意义六