体内药物分析第七章 免疫分析法

1、 1 1、熟悉免疫分析法的基础知识、熟悉免疫分析法的基础知识 2 2、了解放射免疫分析法、酶免疫分析法、化学、了解放射免疫分析法、酶免疫分析法、化学 发光免疫分析法、荧光免疫分析法发光免疫分析法、荧光免疫分析法 第一节：概第一节：概 述述 基本原理基本原理 基本条件基本条件 方法分类方法分类 B B代表结合的标记抗原；代表结合的标记抗原； F F代表游离的标记抗原；代表游离的标记抗原； T T代表总的标记抗原。代表总的标记抗原。 B/F-Ag B/(B+F)100%-Ag 抗原决定簇抗原决定簇(Cluster)的数的数 量、性质及立体构型。量、性质及立体构型。 抗原结合段抗原结合段(fragm

2、ent of antigen binding，IgFab)与相应抗原决定簇的结合能力与相应抗原决定簇的结合能力。 分子分子 结构及立体构型相互吻合结构及立体构型相互吻合 标记抗原、未标记抗原和特异抗体标记抗原、未标记抗原和特异抗体 免疫原性和抗原特异性免疫原性和抗原特异性 全抗原全抗原 半抗原半抗原 人工完全抗原人工完全抗原 载体的本质是蛋白质动物血清蛋白最常用。载体的本质是蛋白质动物血清蛋白最常用。 牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA)、 兔血清白蛋白兔血清白蛋白(RSA)、人血清、人血清 白蛋白白蛋白(HSA) 鉴定的目的：测定人工抗原（药物）与蛋鉴定的目的：测定人工抗原（药物）与蛋 白质的

3、结合比白质的结合比 光谱分析法光谱分析法 化学分析法化学分析法 放射性同位素法放射性同位素法 (1)(1)光谱分析法光谱分析法 (2)(2)化学分析法化学分析法 三硝基苯磺酸钠或二硝基酚三硝基苯磺酸钠或二硝基酚 (3)(3)放射性同位素标记法放射性同位素标记法 1特异抗体特异抗体(Specific Antibody) 抗体：单克隆抗体和多克隆抗体抗体：单克隆抗体和多克隆抗体( (抗血清抗血清) )两大类两大类 水剂：水剂： 福氏完全佐剂福氏完全佐剂( (Freunds Complete Adjuvant) ) 福氏不完全佐剂福氏不完全佐剂 家兔家兔 羊、豚鼠羊、豚鼠 无菌操作无菌操作 羊羊 家

4、兔家兔 (1)(1)滴度滴度(Titer)(Titer) 效价或工作稀释度效价或工作稀释度 抗血清抗血清 标记抗原法标记抗原法 设放射性强度为设放射性强度为T T 沉淀的放射性强度沉淀的放射性强度(B)(B) 标记药物的结合百分率标记药物的结合百分率(B/T(B/T) ) 过量抗体结合率过量抗体结合率 ABAB C C点点 D D点点 1 1按标记物的种类分按标记物的种类分 (1)放射免疫分析放射免疫分析 (radioimmunoassay，RIA) (2)酶免疫分析酶免疫分析 (enzyme immunoassay，EIA) 2 2按是否加入分离剂分按是否加入分离剂分 (1)均相免疫分析均相

5、免疫分析(Itomogeneous lmmunoassay) (2)非均相免疫分析非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay) 放射性同位素标记抗原放射性同位素标记抗原 F F与与B B的分离技术的分离技术 放射免疫测定仪放射免疫测定仪 标准曲线的制备与样品测定步骤标准曲线的制备与样品测定步骤 方法评价方法评价 应用举例应用举例 特点：特点： 。 mci g-1或或mciml-1 (放化纯度放化纯度) 标标 记抗原的纯度决定记抗原的纯度决定RIARIA的特异性的特异性而标记而标记 抗原的放射性比度则决定抗原的放射性比度则决定RIARIA的灵敏度的灵敏度 125I的特点是

6、： 的特点是： 3 3H H的特点是： 的特点是： 1125I标记抗原的制备标记抗原的制备 氧化法氧化法H H2 2O O2 2及氯胺及氯胺T T 等，目前应用最多的是氯胺等，目前应用最多的是氯胺T T 定位标记和非定位标记定位标记和非定位标记 非定位标记非定位标记 定位标记定位标记 1 1、沉淀法、沉淀法 2 2、吸附法、吸附法 3 3、固相法、固相法 4 4、双抗体法、双抗体法 ( (一一) )沉淀法沉淀法 硫酸铵、亚硫酸氢钠、乙醇、异丙醇硫酸铵、亚硫酸氢钠、乙醇、异丙醇 优点：快速、简便、价廉优点：快速、简便、价廉 缺点缺点 分离原理：分离原理： 第二抗体第二抗体( (抗一抗体抗一抗体)

7、 ) 标记药物标记药物( (抗抗 原原- -第一抗体第一抗体- -第二抗体结合物第二抗体结合物 一类是一类是计数器计数器(-Counter) 一类是液体闪烁测量仪一类是液体闪烁测量仪(Liquid Scintillation Counter) 作用：作用： 条件：条件： 烷基苯类，甲苯烷基苯类，甲苯、对二甲苯、对二甲苯、1 1，2 2，4 4三甲苯三甲苯 醚类，醚类，1 1，4 4二氧六环二氧六环 作用：作用： 要求：要求： 对联三苯对联三苯(TP)、2，5二苯基噁唑二苯基噁唑 (PPO)、2苯基苯基5(4联苯基联苯基)1，3，4噁二噁二 唑唑(PBD) 计数瓶计数瓶( (或称闪烁杯或称闪烁杯

8、) )： 光电倍增管：光电倍增管： (T)(T) (T)(T) (B)(B)(F)(F) 计数率计数率 标准抗原标准抗原( (待测药物标准品待测药物标准品) )的浓度的浓度 (B(B) ) B B=(B=(BT)T)100100 B B=(B=(BB B0 0) )100100 酶标记抗原酶标记抗原 均相酶免疫分析均相酶免疫分析 非均相酶免疫分析非均相酶免疫分析 方法评价方法评价 应用示例应用示例 一、酶标记抗原一、酶标记抗原 ( (一一) )标记酶的选择标记酶的选择 特异性强特异性强，酶蛋白分子中应具有足够的活性基团，以便能，酶蛋白分子中应具有足够的活性基团，以便能 与药物结合。与药物结合。

9、 活性要高活性要高，即当底物浓度低时，确有较高的催化反应率。，即当底物浓度低时，确有较高的催化反应率。 酶的活性不易受样品中其它成分影响，有较好的稳定性。酶的活性不易受样品中其它成分影响，有较好的稳定性。 酶的酶的纯度要高纯度要高，且生物体液中应无标记酶、底物、抑制剂，且生物体液中应无标记酶、底物、抑制剂 及其它干扰物质存在。及其它干扰物质存在。 酶的酶的活性测量方法活性测量方法应简单、灵敏、精密和快速。应简单、灵敏、精密和快速。 酶的来源、纯化、供应等应酶的来源、纯化、供应等应方便、价廉方便、价廉。 1 1辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP):(HRP):约有约有5050的的EIAEIA使

10、用此酶。使用此酶。 2 2碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶(AP):AP(AP):AP标记的结合物性质稳定，其标记的结合物性质稳定，其 活性可用分光光度计或荧光计测量。活性可用分光光度计或荧光计测量。 3 36-6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD): (G-6-PD): 通常用于均相通常用于均相EIAEIA。 4 4- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶(-Gal): (-Gal): 适用于均相适用于均相EIAEIA和非均相和非均相 EIAEIA。 5 5苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶(MDH): (MDH): 多用于尿样的均相多用于尿样的均相EIAEIA。 ( (二二) )底物的选择底物的选择 无色、

11、无毒能溶水；无色、无毒能溶水； 化学性质稳定、不受光照的影响；化学性质稳定、不受光照的影响； 转化率高，在酶催化下可产生大量的有色物质；转化率高，在酶催化下可产生大量的有色物质； 显色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成显色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成 正比；正比； 应有终止酶反应的试剂。应有终止酶反应的试剂。 常用酶的底物常用酶的底物 1 1、辣根过氧化物酶的底物：邻苯二胺（、辣根过氧化物酶的底物：邻苯二胺（OPDOPD）、）、5-5-氨基水氨基水 杨酸（杨酸（5-ASA5-ASA）、四甲基联苯胺及其硫酸盐（）、四甲基联苯胺及其硫酸盐（TMB/TMBSTMB/TMBS） 2 2、

12、碱性磷酸酶底物：对硝基酚磷酸盐溶液（、碱性磷酸酶底物：对硝基酚磷酸盐溶液（p-NPPp-NPP）、）、4-4- 甲基伞酮基甲基伞酮基- -磷酸盐（磷酸盐（4-MUP4-MUP） 3 3、-D-半乳糖苷酶底物：邻硝基苯半乳糖苷酶底物：邻硝基苯-D-半乳糖吡喃苷半乳糖吡喃苷 （o-NPG）、氯酚红）、氯酚红-D-半乳糖吡喃苷（半乳糖吡喃苷（CPRG）、试卤）、试卤 灵灵-D-半乳糖吡喃苷（半乳糖吡喃苷（RG） 4、葡萄糖氧化酶底物：与辣根过氧化物酶底物相同、葡萄糖氧化酶底物：与辣根过氧化物酶底物相同 （三）：酶标记药物的制备（三）：酶标记药物的制备 酶标药物的酶标药物的酶活性酶活性和和免疫活性免疫

13、活性决定了酶免疫测决定了酶免疫测 定法的灵敏度，因此酶标药物成为定法的灵敏度，因此酶标药物成为EIAEIA的关键。的关键。 选择制备方法应注意以下原则：选择制备方法应注意以下原则： （1 1）对酶和抗体的活性没有影响）对酶和抗体的活性没有影响 （2 2）生成的结合物是可溶的、稳定的）生成的结合物是可溶的、稳定的 （3 3）反应条件易控制）反应条件易控制 （4 4）制备方法简单、能重现）制备方法简单、能重现 均相酶免疫分析均相酶免疫分析(Homogeneous Enzyme Immunoassay)(Homogeneous Enzyme Immunoassay) 是指酶标抗原是指酶标抗原(Ag(

14、AgE E) )同抗体同抗体(Ab(Ab) )结合后，所形成的结合后，所形成的 酶标抗原一抗体结合物酶标抗原一抗体结合物(Ag(AgE EAbAb) )可使酶的活性发生可使酶的活性发生 改变改变( (增强或减弱增强或减弱) )，且不需将游离的酶标药物，且不需将游离的酶标药物(Ag(AgE E) ) 与结合的与结合的(Ag(AgE E一一AbAb) )酶标药物分开，就可直接通过测酶标药物分开，就可直接通过测 定酶活性的变化，求出样品含量的方法。定酶活性的变化，求出样品含量的方法。 酶增强酶增强( (放大放大) )免疫测定技术免疫测定技术(Enzyme Multiplied (Enzyme Mul

15、tiplied ImnunoassayImnunoassay、techniquetechnique，EMIT)EMIT)，或称，或称“结合酶免结合酶免 疫分析法疫分析法” EMITEMIT法通常使用法通常使用6-6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-(G-6- PD)PD)作标记酶，其原理是标记在待测药物上的作标记酶，其原理是标记在待测药物上的G-G- 6-PD6-PD在辅酶在辅酶I I参与下能将底物参与下能将底物6-6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖(G-(G- 6-P)6-P)氧化成氧化成6-6-磷酸葡萄糖酸，而辅酶磷酸葡萄糖酸，而辅酶I I本身则被本身则被 还原成还原型辅酶还原成还原型辅酶

16、I(NADH)I(NADH)。 在该反应过程中，辅酶在该反应过程中，辅酶I I的结构发生了变化，的结构发生了变化， 导致导致NADNAD与与NADHNADH的紫外吸收光谱形状不同，还原的紫外吸收光谱形状不同，还原 型辅酶型辅酶I I在在340nm340nm处有最大吸收，而辅酶处有最大吸收，而辅酶I I在此波在此波 长处则吸收甚小长处则吸收甚小。 未标记药物未标记药物(Ag)(Ag)抗体辅酶抗体辅酶I(NAD)I(NAD)底物底物(G-6-P)(G-6-P)抗原抗原- -抗抗 体结合物体结合物Ag-AbAg-Ab酶标药物酶标药物(Ag(AgE E) )。酶标药物与未标记药物互相竞争。酶标药物与未

17、标记药物互相竞争 有限量的抗体有限量的抗体(Ab(Ab) )，当这种竞争结合反应达到平衡之后，则有部分，当这种竞争结合反应达到平衡之后，则有部分 酶标药物与抗体相结合，从而使结合酶标药物酶标药物与抗体相结合，从而使结合酶标药物(Ag(AgE E-Ab-Ab) )上的酶活性上的酶活性 受到抑制，不能再同底物发生作用，而只有游离酶标药物受到抑制，不能再同底物发生作用，而只有游离酶标药物(AgE(AgE) )上上 的酶才有活性，能作用于底物产生测定信号。如果样品中待测药物的酶才有活性，能作用于底物产生测定信号。如果样品中待测药物 的浓度越高，则竞争抑制的结果使游离酶标药物的量增多，亦即酶的浓度越高，

18、则竞争抑制的结果使游离酶标药物的量增多，亦即酶 的活性随着待测药物浓度的增加而增强，故有的活性随着待测药物浓度的增加而增强，故有“酶增强免疫技术酶增强免疫技术” 之称。之称。 由于游离酶标药物量的增多，能使更多的由于游离酶标药物量的增多，能使更多的NADNAD参与氧化反应，参与氧化反应， 生成更多的酶反应产物生成更多的酶反应产物NADHNADH。根据。根据NADHNADH在在340nm340nm处有紫外吸收的原处有紫外吸收的原 理，便可用分光光度计测定吸收度，求出待测药物的含量。理，便可用分光光度计测定吸收度，求出待测药物的含量。 非均相免疫分析：指酶标抗原非均相免疫分析：指酶标抗原(Ag(A

19、gE E) )同抗体同抗体(Ab(Ab) )结合结合 后，形成的酶标抗原后，形成的酶标抗原- -抗体结合物抗体结合物(Ag(AgE E-Ab-Ab) )与游离的酶与游离的酶 标抗原标抗原(A(AE E) )一样，其标记酶都具酶活性。因此必须将一样，其标记酶都具酶活性。因此必须将 AgAgE EAbAb与游离的与游离的AgAgE E分开后，再测定酶活性的变化，以分开后，再测定酶活性的变化，以 求出待测药物的含量。求出待测药物的含量。 酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent(Enzyme Linked Immunosorbent AssayAssa

20、y，ELISA)ELISA)：将一种反应物固定在固相载体上，当：将一种反应物固定在固相载体上，当 另一种反应物与其结合后，可通过洗涤、离心等方法将另一种反应物与其结合后，可通过洗涤、离心等方法将 液相中未结合的其它物质倾去，然后测定结合在固相上液相中未结合的其它物质倾去，然后测定结合在固相上 的酶活性。的酶活性。 竞争法是将抗体直接吸附在有小孔的反应板孔内，竞争法是将抗体直接吸附在有小孔的反应板孔内， 然后将待测样品和定量的酶标药物加入孔内并混匀。然后将待测样品和定量的酶标药物加入孔内并混匀。 将反应板置于适宜温度下温育一定时间，待酶标药物将反应板置于适宜温度下温育一定时间，待酶标药物 与未标

21、记药物的竞争结合反应达到平衡后，洗去未同与未标记药物的竞争结合反应达到平衡后，洗去未同 抗体结合的游离药物，而与抗体结合的酶标药物和未抗体结合的游离药物，而与抗体结合的酶标药物和未 标记药物标记药物( (固相载体沉淀部分固相载体沉淀部分) )则保留在孔内。然后将则保留在孔内。然后将 底物加入孔内，结合在抗体上的酶标药物能催化底物，底物加入孔内，结合在抗体上的酶标药物能催化底物， 发生水解、氧化或还原等化学反应，从而产生可测信发生水解、氧化或还原等化学反应，从而产生可测信 号。测定时以空白试验号。测定时以空白试验( (孔内不加待测样品孔内不加待测样品) )作参比。作参比。 ElAElA优点：优点

22、： 1.1.避免对人体的放射性伤害、环境的污染避免对人体的放射性伤害、环境的污染 2.2.酶标记物较稳定，半衰期可超过酶标记物较稳定，半衰期可超过1 1年。年。 3.3.酶免疫反应通常不需要酶免疫反应通常不需要 4.4.不需要温育不需要温育 5.5.不需将与抗体结合的标记药物同游离的标记药物分开，不需将与抗体结合的标记药物同游离的标记药物分开， 便可直接测定。便可直接测定。 6.6.产生的信号用普通的可见一紫外分光光度计就可测定，产生的信号用普通的可见一紫外分光光度计就可测定， 不需昂贵的仪器没备。不需昂贵的仪器没备。 缺点：缺点： 标记酶不像同位素标记物、荧光标记物那样能直接标记酶不像同位素

23、标记物、荧光标记物那样能直接 产生信号，而必须要何其它试剂，如酶底物、辅酶的产生信号，而必须要何其它试剂，如酶底物、辅酶的 参与，才能完成酶反应，引起吸收光谱等变化后方可参与，才能完成酶反应，引起吸收光谱等变化后方可 进行测定。进行测定。 血样中利多卡因的测定血样中利多卡因的测定 1 1药物与试剂药物与试剂 试剂试剂A A：内含抗体：内含抗体( (由利多卡因与大分子载体结合成人由利多卡因与大分子载体结合成人 工抗原后免疫绵羊而得工抗原后免疫绵羊而得) )、底物、底物(G-6-P)(G-6-P)及辅酶及辅酶I(NAD)I(NAD)。 保存剂（保存剂（0.05mol/L tris-HCl0.05m

24、ol/L tris-HCl缓冲液）。缓冲液）。 试剂试剂B B：内含酶标药物：内含酶标药物( (用用G-6-PDG-6-PD标记的利多卡因标记的利多卡因) )及保及保 存剂存剂(pH 7.9)(pH 7.9)。 其它试剂：其它试剂：标准品和质控对照品。标准品和质控对照品。0.055mol/L 0.055mol/L tris-HCltris-HCl缓冲液缓冲液 2 2样品测定样品测定 精密量取血浆或血清样品精密量取血浆或血清样品50l50l，于，于2ml2ml小烧杯中，小烧杯中， 加入加入TBTB缓冲液缓冲液250l250l，混匀后，吸出，混匀后，吸出5l5l置另一置另一2ml2ml 小烧杯中，

25、再加入小烧杯中，再加入TBTB缓冲液缓冲液250l250l，充分混匀。然后，充分混匀。然后 加入试剂加入试剂A50lA50l及及TBTB缓冲液缓冲液250l250l，再加入试剂，再加入试剂B B 50l50l及及TBTB缓冲液缓冲液250l250l，混匀，立即将反应液吸入，混匀，立即将反应液吸入 分光光度计的样品池中，在分光光度计的样品池中，在340nm340nm波长处测吸收度。波长处测吸收度。 根据标准曲线，求出血样中利多卡因的浓度。根据标准曲线，求出血样中利多卡因的浓度。 3 3标准曲线的制备标准曲线的制备 将药盒提供的将药盒提供的6 6个装有不同量的利多卡因标准品个装有不同量的利多卡因标准品 小瓶取出，在每瓶中加入小瓶取出，在每瓶中加入1.0ml1.0ml蒸馏水，即得到浓度蒸馏水，即得到浓度 分别为分别为0 0、1.01.0、2.02.0、3.03.0、5.05.0及及12.0mg/L12.0mg/L的标准品的标准品 溶液。然后分别吸