代谢调节对动脉粥样硬化相关疾病的影响及其机制研究

1、代谢调节对动脉粥样硬化相关疾病的影响及其机制研究 研究背景以运动训练为主的心脏康复治疗是改善冠状动脉粥样硬化性心脏 病冠心病患者预后的有效手段。运动训练能够增强冠心病患者运动耐量 , 降低 心血管死亡率与住院率 , 显著提高生活质量。冠心病患者控制心绞痛病症后需要及早进行适当的运动训练 , 并在运动训练 同时接受标准、有效的药物治疗。 以他汀类药物为代表的调脂治疗是冠心病一级 与二级预防的基石。然而, 运动训练同时服用他汀类药物抵消了运动训练对运动耐量的获益作用。 他汀类药物的骨骼肌不良反响导致患者运动耐量下降。他汀类药物引起的骨骼肌不良反响可以表现为肌肉酸痛、疲劳或痉挛 ,38% 他汀类药物

2、相关肌痛患者不能承受在中度以下日常活动。流行病学研究显示 , 他 汀类药物骨骼肌不良反响发生率高达 7%- 29%他汀类药物的不良反响是患者停药的主要原因 , 但是停用他汀类药物导致冠 心病患者死亡率升高。因此需要探究他汀类药物导致运动能力降低的机制 , 并寻 找有效的解决方法。线粒体功能障碍是他汀类药物相关骨骼肌损伤的主要机制。 体外研究发现他汀类药物能够结合于线粒体电子传递链复合体川的Q0的位点，阻断线粒体电子传递链,进而导致ATP产生减少且骨骼肌细胞氧化应激加重。能量供给减少与氧化应激最终导致骨骼肌纤维萎缩 , 骨骼肌功能明显受损。 因此, 改善骨骼肌线粒体功能是降低他汀相关骨骼肌损伤的

3、关键。曲美他嗪能够调节线粒体功能 ,并增强骨骼肌的运动能力。 研究显示,曲美他 嗪能抑制棕榈酸造成的线粒体分裂并改善线粒体功能。心衰模型中曲美他嗪通过增强线粒体复合体活性与抑制线粒体电子漏保护 心肌细胞。曲美他嗪对骨骼肌也有保护作用。研究发现曲美他嗪能够抑制饥饿和炎症因子引起的骨骼肌细胞萎缩和细胞 骨架紊乱。另外临床研究显示 , 在传统抗心绞痛药物的根底上 ,早期加用曲美他嗪 , 能够增强稳定性心绞痛患者运动耐量 , 降低心绞痛发生频率。运动训练联合曲美他嗪更显著提高缺血性心脏病患者运动耐量。 但曲美他嗪 是否改善他汀类药物相关的运动能力下降尚无研究报道。为此,本研究以高脂喂养的 ApoE-/

4、- 小鼠为研究对象 , 建立他汀类药物相关 骨骼肌损伤动物模型 , 探讨曲美他嗪是否通过调节骨骼肌能量代谢改善他汀类药 物相关运动能力下降。 研究目的 1.探讨运动训练中 , 曲美他嗪能否降低他汀类药 物所致骨骼肌损伤 , 增强运动能力 ;2. 明确曲美他嗪是否通过改善线粒体功能与 调节能量代谢降低骨骼肌损伤。研究方法1.实验动物分组4周龄ApoE-/-小鼠高脂饮食喂养4周后称重,随 机分为五组 : 对照组、运动组、运动 +辛伐他汀组、运动 +曲美他嗪组、运动 +辛伐 他汀 +曲美他嗪组。运动组、运动 +辛伐他汀组、运动 +曲美他嗪组、运动 +辛伐他 汀+曲美他嗪组的小鼠进行 8周的跑步训练

5、,每周跑步训练 5天。运动 +辛伐他汀组小鼠在运动训练的根底上给予 20mg/kg/d 辛伐他汀灌胃。 运动+曲美他嗪组小鼠在运动训练的根底上给予 30mg/kg/d 曲美他嗪灌胃。运动 +辛伐他汀 +曲美他嗪组小鼠在运动训练的根底上给予20mg/kg/d 辛伐他汀与 30mg/kg/d 曲美他嗪灌胃。灌胃总时间为 8 周。2. 运动能力检测试验末检测各组小鼠运动能力。单杠实验：准备45cmx 45cm铁丝网 , 铁丝粗 2mm 网, 格 18mm。铁丝网悬于软垫上方50cm小鼠置于铁丝网中心，经头侧翻转铁丝网，计算 小鼠力竭掉落时间。每只小鼠检测3次,计算平均值，每次试验间隔20min以上。

6、拉力检测：训练 小鼠双上肢拉紧测力计 , 轻拉小鼠尾使小鼠腾空直至小鼠上肢离开测力计 , 记录 测力计显示数值。检测 3 次, 计算平均值。运动耐力检测 ： 采用平台式跑步机进行耐力检测。起始运动速度 13m/min, 每 3min 速度增加 2m/min, 起始跑道坡度为 0, 每 3min 坡度增加 2直至 14。纪录小鼠力竭时运动时间与运动距离。3. 血液指标检测小鼠心尖取血约 1mL,肝素抗凝,2 000rpm4 C离心15min,分 离血浆。拜耳 1650 血生化自动检测仪检测血浆葡萄糖、总胆固醇、低密度脂蛋 白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯与游离脂肪酸水平。采用试剂盒检测血浆

7、CK乳酸水平。4.病理学检测对腓肠肌进行 HE染色观 察骨骼肌形态改变。Laminin免疫荧光观察中心核纤维水平。 Slow MyHC与 Fast MyHC免疫荧光 检测肌纤维分型。对腓肠肌进行PAS染色观察骨骼肌糖原含量。Gomori染色检测碎裂红纤维(RRF)水平。5. 骨骼肌线粒体功能检测提取骨骼肌线粒体 , 采用试剂盒检测线粒体复合体 川、柠檬酸合酶活性JC-1检测线粒体膜电位。6.骨骼肌氧化应激水平检测提取 骨骼肌线粒体，Amplex Red检测线粒体内过氧化氢水平；腓肠肌组织制成匀浆，检 测 SOD与 GSH/GSS水平。结果1.运动训练与辛伐他汀对 ApoE-/-小鼠的血脂、CK

8、水平的影响与对照 组相比,运动组ApoE-/-小鼠血脂、CK水平无显著变化；与运动组相比,运动+辛伐 他汀组 ApoE-/- 小鼠血浆脂质水平显著降低 ; 与运动组相比 , 运动+辛伐他汀组 ApoE-/-小鼠血浆CK水平显著升高。说明辛伐他汀能够降低运动训练 ApoE-/-小 鼠的血脂水平，升高血浆CK水平,即辛伐他汀能够导致骨骼肌损伤。2.运动训练与辛伐他汀对 ApoE-/-小鼠运动能力的影响与对照组相比,运动 组 ApoE-/- 小鼠的运动能力显著增强。与运动组相比 , 运动+辛伐他汀组 APoE-/- 小鼠运动能力降低。上述结果说明辛伐他汀能够抵消运动训练对 ApoE-/- 小鼠运动能

9、力的增强 作用。 3. 运动训练与辛伐他汀对 ApoE-/- 小鼠骨骼肌纤维的影响与对照组相比 , 运动组 ApoE-/- 小鼠骨骼肌纤维横截面积增加 ； 与运动组相比 , 运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠肌纤维横截面积降低。中心核纤维是骨骼肌纤维损伤后修复的表现 , 与对照组相比 , 运动组ApoE-/- 小鼠骨骼肌中心核纤维无显著变化 ； 与运动组相比 , 运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠骨骼肌中心核纤维增加。说明辛伐他汀能够导致骨骼肌纤维萎缩与 损伤。4. 运动训练与辛伐他汀对骨骼肌纤维分型的影响与对照组 ApoE-/- 小鼠相 比,运动组ApoE-/-小鼠慢型肌纤维比例显著

10、增加。与运动组相比,运动+辛伐他 汀组 ApoE-/- 小鼠慢型肌纤维减少。另外与运动组相比 ,运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠慢型肌纤维与快型肌纤 维横截面积显著降低。说明运动训练能够增加慢型肌纤维含量 ,辛伐他汀降低运 动训练 ApoE-/- 小鼠慢型肌纤维含量 , 并导致快型与慢型肌纤维萎缩。5. 运动训练与辛伐他汀对 ApoE-/- 小鼠骨骼肌有氧代谢的影响与对照组相 比,运动组ApoE-/-小鼠骨骼肌糖原含量降低,与运动组相比，运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠骨骼肌糖原含量增加。另外与运动组相比 , 运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠血浆乳酸含量增加 , 说明辛伐他汀

11、抑制运动训练 ApoE-/- 小鼠骨骼 肌有氧代谢。与对照组相比，运动组ApoE-/-小鼠骨骼肌RRF无显著变化；与运动组相比， 运动+辛伐他汀组ApoE-/-小鼠骨骼肌RRF显著增加,提示辛伐他汀导致线粒体功 能障碍。6.曲美他嗪与辛伐他汀对运动训练 ApoE-/-小鼠血脂、CK水平的影响与 运动组相比 , 运动+曲美他嗪组 ApoE-/- 小鼠血浆葡萄糖与脂质水平无显著变化。与运动+曲美他嗪组相比 ,运动+辛伐他汀+曲美他嗪组 ApoE-/- 小鼠血脂水 平显著降低。辛伐他汀导致运动训练ApoE-/-血浆CK水平升高；与运动+辛伐他汀组相比,运动+辛伐他汀+曲美他嗦组CK水平降低。上述结果

12、说明曲美他嗪不降低小鼠血脂水平 , 也不影响辛伐他汀的降脂作用 但是曲美他嗪能够显著降低血浆 CK水平，即曲美他嗪能够降低辛伐他汀导致的 骨骼肌损伤。 7. 曲美他嗪与辛伐他汀对运动训练 ApoE-/- 小鼠运动能力的影响与 运动组相比,运动+辛伐他汀组ApoE-/ 小鼠运动能力显著降低。与运动 +辛伐他汀组相比 , 运动 +辛伐他汀 +曲美他嗪组 ApoE-/- 小鼠运动能 力增强。上述结果说明 , 运动训练中 , 辛伐他汀能够降低 ApoE-/- 小鼠运动能力 , 而辛伐他汀根底上加用曲美他嗪后 ApoE-/- 小鼠运动能力增强 , 因此运动训练 ApoE-/- 小鼠的运动能力得到恢复。8

13、.曲美他嗪与辛伐他汀对运动训练 ApoE-/- 小鼠骨骼肌纤维的影响与运动 组相比, 运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠骨骼肌纤维横截面积降低 ；与运动+辛伐他汀组相比 , 运动+辛伐他汀+曲美他嗪组小鼠骨骼肌纤维横截面积显著增加 ； 说 明曲美他嗪可以改善辛伐他汀导致的运动训练 ApoE-/ 小鼠骨骼肌纤维萎缩的 现象。运动组相比 ,运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠骨骼肌中心核纤维百分比升高 与运动+辛伐他汀组相比 , 运动+辛伐他汀+曲美他嗪组小鼠骨骼肌中心核纤维百 分比显著降低 ,说明辛伐他汀根底上加用曲美他嗪后运动训练 ApoE-/- 小鼠骨骼 肌纤维损伤减少。9.曲美他嗪与

14、辛伐他汀对运动训练 ApoE-/- 小鼠肌纤维分型的影响与运动 组相比,运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠慢型肌纤维减少 ;与运动+辛伐他汀组相 比,运动+辛伐他汀+曲美他嗪组 ApoE-/- 小鼠慢型肌纤维显著增加。与运动组相 比,运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠慢型肌纤维与快型肌纤维横截面积降低 :与运 动+辛伐他汀组相比 ,运动+辛伐他汀 +曲美他嗪组慢型肌纤维与快型肌纤维横截 面积均显著增加。上述结果说明辛伐他汀导致运动训练 ApoE-/- 小鼠慢型肌纤维含量减少 , 慢 型与快型肌纤维萎缩 ;辛伐他汀加用曲美他嗪后运动训练 ApoE-/- 小鼠慢行肌纤 维含量增加 ,肌纤维

15、增粗。 10.曲美他嗪与辛伐他汀对运动训练 ApoE-/- 小鼠骨骼 肌有氧代谢的影响与运动组相比 ,运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠骨骼肌糖原含 量增加;与运动+辛伐他汀组相比 ,运动+辛伐他汀+曲美他嗪组 ApoE-/- 小鼠骨骼 肌糖原含量显著降低。与运动组相比 ,运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠血浆乳酸水平增加 ;与运动+ 辛伐他汀组相比 ,运动+辛伐他汀 +曲美他嗪组 ApoE-/ 小鼠血浆乳酸水平显著 降低。另外与运动组相比,运动+辛伐他汀组ApoE-/-小鼠骨骼肌RRF增加;与运 动+辛伐他汀组相比,运动+辛伐他汀+曲美他嗪组ApoE-/-小鼠骨骼肌RRF显著降上述结

16、果说明辛伐他汀抑制运动训练 ApoE-/- 小鼠骨骼肌有氧代谢 , 辛伐他 汀根底上加用曲美他嗪后运动训练 ApoE-/- 小鼠骨骼肌有氧代谢得到恢复。 11. 曲美他嗪在辛伐他汀所致运动训练 ApoE-/- 小鼠骨骼肌线粒体功能障碍中的作 用与对照组相比,运动训练显著提高ApoE-/-小鼠骨骼肌线粒体复合体川活性； 与运动组相比,运动+辛伐他汀组ApoE-/-小鼠骨骼肌线粒体复合体川活性降低； 与运动+辛伐他汀组相比,运动+辛伐他汀+曲美他嗪组ApoE-/-小鼠骨骼肌线粒 体复合体川活性显著增高。线粒体复合体活性是维持线粒体膜电位的重要因素。与对照组相比 , 运动组 ApoE-/- 小鼠骨骼

17、肌线粒体膜电位增高 ； 与运动组相比 , 运动+辛伐他汀组 ApoE-/-小鼠骨骼肌线粒体膜电位降低；与运动+辛伐他汀组相比,运动+辛伐他汀 组+曲美他嗪组ApoE-/ 小鼠膜电位增高。我们通过柠檬酸合酶活性检测线粒体含量。 运动训练提高 ApoE-/- 小鼠骨骼 肌线粒体柠檬酸合酶活性 ；与运动组相比 , 运动+辛伐他汀组柠檬酸合酶活性降低 ； 与运动+辛伐他汀组相比 , 运动+辛伐他汀+曲美他嗪组柠檬酸合酶活性显著增高。上述结果说明曲美他嗪能够抵消辛伐他汀所致骨骼肌线粒体功能障碍。 12. 曲美他嗪对辛伐他汀所致氧化应激的作用与运动组相比 , 运动+辛伐他汀组 ApoE-/- 小鼠骨骼肌线

18、粒体过氧化氢水平升高 ； 与运动+辛伐他汀组相比 , 运动+辛 伐他汀+曲美他嗪组ApoE-/-小鼠骨骼肌线粒体过氧化氢水平降低。与运动组相比，运动+辛伐他汀组ApoE-/-小鼠骨骼肌SOD舌性与GSH/GSSG 降低；与运动+辛伐他汀组相比,运动+辛伐他汀+曲美他嗪组ApoE-/-小鼠骨骼肌 SOD舌性增强,GSH/GSSGI加。上述结果说明辛伐他汀能够导致运动训练ApoE-/-小鼠骨骼肌氧化应激 , 加用曲美他嗪后运动训练 ApoE-/- 小鼠骨骼肌氧化应激水 平降低,即证实曲美他嗪能够改善辛伐他汀导致的运动训练 ApoE-/- 小鼠骨骼肌 氧化应激。结论 1.曲美他嗪能够降低辛伐他汀所致

19、 ApoE-/- 小鼠骨骼肌损伤 ,恢复运动 训练对运动能力的改善作用 ;2. 曲美他嗪通过改善线粒体功能实现骨骼肌保护作 用。研究背景我国冠状动脉粥样硬化性心脏病 冠心病 死亡率仍呈现上升趋势。糖尿病是冠心病的最重要的危险因素。与单纯冠心病相比 , 合并糖尿病的冠 心病患者发病年龄更早 , 斑块不稳定性增加 , 导致心力衰竭与死亡率显著增高。而冠心病患者合并糖代谢紊乱的比例高达 76.9%。因此探讨糖尿病状态下动 脉粥样硬化加重的机制是改善冠心病患者预后的重要途径。系统性慢性炎症是动脉粥样硬化与糖尿病发病的共同机制 , 糖尿病相关系统 性慢性炎症是动脉粥样硬化病变加重的主要原因。 脂肪组织是

20、系统性慢性炎症的 发源地。除脂肪细胞外 , 脂肪组织内包含几乎所有种类的免疫细胞。因此脂肪组织不 仅在胰岛素作用下以脂质的形式储存能量 , 同时在代谢改变时调控炎症反响。体重和代谢正常个体的脂肪组织内炎症反响趋于抑制状态 , 然而在大量能量 超载时, 脂肪组织内免疫体系激活。胰岛素抵抗的脂肪细胞与激活的免疫细胞分 泌大量脂肪因子、炎症因子以内分泌的形式介导其他器官糖代谢紊乱与慢性炎症。脂肪组织内巨噬细胞是介导脂肪组织慢性炎症主要的调节细胞和效应细胞。 巨噬细胞是脂肪组织内数量最大的免疫细胞 , 胰岛素抵抗状态下脂肪组织内巨噬 细胞数量可高达脂肪组织总细胞量的 50%。脂肪组织慢性炎症不仅表现为

21、巨噬细胞增加 , 还表现为巨噬细胞表型发生转 化。巨噬细胞可分为M1型经典活化和M2型替代活化巨噬细胞胰岛素抵抗的脂肪组织内多为 M1型巨噬细胞。M1型巨噬细胞具有较强的抗原递呈能力，促进Th1型免疫应答，具有促炎活性。巨噬细胞发生M1型极化后,表达大量趋化因子与促炎因子，不但加重脂肪组 织慢性炎症，而且阻断脂肪细胞胰岛素信号通路。因此研究巨噬细胞M1型极化的 机制将为控制脂肪组织慢性炎症提供可靠的理论依据。脂肪细胞胰岛素抵抗是巨噬细胞 M1型极化的主要原因，脂肪细胞释放的 exosomes介导巨噬细胞激活。Exosomes是细胞内多囊体与质膜融合释放的胞外 囊泡,携带大量与其源细胞功能密切相

22、关的蛋白质和RNA成分,通过受体一配体结合或膜融合等方式启动靶细胞内信号传递 ,调节靶细胞生物学功能。Exosomes是脂肪细胞和巨噬细胞之间往来信息交流的载体。脂肪细胞释放 exosomes招募巨噬细胞,2型糖尿病小鼠的脂肪组织释放的 exosomes可以促进巨 噬细胞炎症活性增强。因此可以通过调节脂肪细胞来源的 exosomes(ADEs携带的信号分子或者其 激活的信号通路,抑制巨噬细胞极化,进而减轻系统性慢性炎症,但是ADEs介导 巨噬细胞极化的分子机制仍待研究。Sonic Hedgehog(Shh)是exosomes携带的重 要分泌型形态因子。Shh分子通过C端的胆固醇修饰与N端有棕榈

23、酸修饰结合于exosomes磷脂 双分子膜,exosomes携带Shh具有更强的活性和更广的分泌范围。Shh在免疫系 统发育中发挥调控作用，成年个体内Shh调节多种免疫细胞增殖分化。巨噬细胞内表达Shh信号通路,是Shh的靶细胞之一。Shh促进巨噬细胞炎 症因子表达 , 参与巨噬细胞激活。研究发现胰岛素抵抗上调Shh表达,因此糖尿病状态下Shh可能通过促进巨 噬细胞向促炎表型转化介导系统性慢性炎症。 本研究将建立脂肪细胞胰岛素抵抗 模型,探讨ADEs携带的Shh对巨噬细胞表型转化的影响,及巨噬细胞极化在脂肪 细胞胰岛素抵抗中的作用。研究目的 1.建立脂肪细胞胰岛素抵抗模型 , 明确胰岛素抵抗脂

24、肪细胞产生的ADEs对巨噬细胞M1型转化的作用;2.探讨ADEs携带Shh介导的 Ptch/PI3K/Gli信号通路在巨噬细胞极化中的作用；3.探讨巨噬细胞M1型转化后 分泌的exosomes对脂肪细胞胰岛素抵抗的影响。研究方法1.脂肪细胞胰岛素抵 抗模型的建立采用胰岛素、 3-异丁基,1- 甲基-黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法 将 3T3-L1 前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞。分化成熟的脂肪细胞分为对照组与胰岛素抵抗组。 胰岛素抵抗组脂肪细胞在 分化成熟后参加高糖高胰岛素刺激 24h。WesternBlot 检测 p/t-IRS1 、p/t-Akt 、细胞膜与细胞浆 Glut4 水平 ,2N

25、BDG 检测葡萄糖摄取，油红O染色检测脂质含量。2.脂肪细胞腺病毒转染对照组与胰 岛素抵抗组脂肪细胞通过 Shh cDNA腺病毒转染上调脂肪细胞与 ADEs Shh表达， 胰岛素抵抗组脂肪细胞通过 Shh ShRNA腺病毒转染下调脂肪细胞与 ADEsShhS达, 倒置荧光显微镜下观察转染效率Western Blot与RT-PCR佥测Shh表达水平。3.提取ADEs获取各组脂肪细胞上清,超速离心获取ADEs透射电镜管观察ADEs超微结构Western Blot检测脂肪细胞与 ADEs Tsg101、CD63 CD81Calnexin与Grp94表达水平；动态光散射测定 ADEs直径分布;West

26、ern Blot与流 式细胞术检测ADEs携带Shh水平。4.ADEs刺激巨噬细胞别离培养小鼠骨髓巨噬 细胞BMDM与RAW264.巨噬细胞,饥饿24h后,50卩g/mmLADEs刺激巨噬细胞24h;为明确Ptch与PI3K是否参与ADEs介导的巨噬细胞表型转化,分别在ADEs刺激 前2h参加20卩M Ptch抑制剂环巴胺，ADEs刺激前1h参加10卩M PI3K抑制剂 LY294002。5. 巨噬细胞极化检测流式细胞术检测 M1型巨噬细胞CD11C+与M2型巨噬细 胞CD206+所占比例；检测巨噬细胞的粘附功能。6.巨噬细胞信号通路检测收集 ADEs刺激的RAW 264.7巨噬细胞蛋白。We

27、stern Blot检测Ptch与Gli蛋白水平，EMSA检测Gli转录活性。Western Blot检测PI3K磷酸化水平。7.脂肪细胞与巨噬细胞共培养采用transwell小室孔径0.4卩m,将脂肪细 胞种于transwell小室上层,将ADEs刺激的RAW264.巨噬细胞接种于transwell 小室下层,共培养24h。8.巨噬细胞来源exosomes刺激脂肪细胞收集ADEs刺激 RAW 264.7巨噬细胞的培养上清,超速离心收集exosomes,刺激分化成熟的 3T3-L1 脂肪细胞。9.脂肪细胞胰岛素抵抗获取共培养后的脂肪细胞 ,提取蛋白质 ,WesternBlot检测HSL与IRS

28、-1的蛋白水平。10.检测血清exosomes抽取健康志愿者与 2 型糖尿病患者外周静脉血 , 别离胶促凝固管别离血清 ； 超速离心提取 exosomes, 流式细胞术检测exosomes表型。结果1.胰岛素抵抗脂肪细胞模型的建立高糖高胰岛素刺激脂肪细胞24h后,脂肪细胞的 IRS-1 Ser307 位点磷酸化水平增高 ,IRS-1 蛋白水平明显降低 ,Akt 磷酸化水平降低；生理剂量胰岛素刺激下GLUT胞膜转位降低,葡萄糖摄取减 少； 脂肪细胞脂质含量增加。上述结果说明我们成功构建了脂肪细胞胰岛素抵抗 模型。2.胰岛素抵抗脂肪细胞来源 ADEs携带Shh增加ADEs提取后鉴定电子显 微镜观察

29、ADEs是膜包被的囊泡状结构,直径在50-100nm之间;ADEs表达CD63CD81 Tsg101,不携带内质网蛋白 Calnexin、Grp94。(2)ADEs携带Shh的检测 前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞的过程中稳定表达Shh,ADEs中Shh含量明显高于超速离心上层液中Shh含量,说明脂肪细胞主要以exosomes的形式分泌Shh。与对照组脂肪细胞来源的 exosomes(CtrlADEs) 相比 , 胰岛素抵抗脂肪细胞来源的 exosomes(IRADEs携带 Shh增加。3.ADES携带的 Shh对 BMD与 RAV264.7 巨噬细胞表型转化的影响与 CtrlADEs相比,IR

30、ADEs促进BMD与RAW264.7巨噬 细胞M1型极化，抑制M2型极化。中和抗体封闭IRADEs携带的Shh后,与IRADEs刺激的巨噬细胞相比,巨噬细 胞M1型极化显著降低,M2型极化增加。通过腺病毒转染下调IRADEs携带Shh水 平,IRADEs介导的巨噬细胞M1型极化降低。与 CtrlADEs 相比, 过表达 Shh 的 CtrlADEs(AdV-ShhCtrlADEs) 促进巨噬 细胞M1型极化。与IRADEs相比，过表达Shh的IRADEs(AdV-Shh IRADEs)进 一步促进巨噬细胞M1型极化。上述结果说明ADEs携带的Shh促进巨噬细胞M1型极化,抑制M2型极化,增强巨噬细胞粘附功能。4.Ptch/PI3K/Gli 通路在ADEs携带Shh介导的巨噬细胞M1型极化中的作用ADEs携带的Shh刺激巨噬细胞Ptch/Gli表达上调与