赤芍与白芍药材高效毛细管电泳指纹图谱方式学研究

1、赤芍与白芍药材高效毛细管电泳指纹图谱方式学研究王磊磊，陈军辉，王虹，殷月芬，王小如，杨东方【摘要】目的确信赤芍和白芍的高效毛细管电泳分析方式，成立 赤芍和白芍的高效毛细管电泳法（hpce）指纹图谱。方式hpce工作条 件：采纳未涂层熔融石英毛细管（内径75 um,有效长度50 cm）,分 离电压为25 kv,柱温25 c,二极管阵列检测器（dad）检测波长为220 nm,缓冲液为30 mmol/l硼砂（ph =溶液。按此条件对来自不同产地 的7种赤芍样品和8种白芍样品进行了分析。结果成立了赤芍和白芍 hpce指纹图谱，采纳中药指纹图谱相似度计算软件，以系统生成的对 照指纹图谱为对照模板对不一样

2、品的图谱进行相似度计算。结论该方 式简捷、有效，能够用于赤芍和白芍药材的质量操纵。【关键词】赤芍；白芍；高效毛细管电泳法；指纹图谱abstract： objectiveto set up a modern high performance capillary electrophoresis analysis method for separating and detecting radix paeoniae alba and radix paeoniae rubra and establish their fingerprints. methodsseven samples of radix

3、paeoniae alba and eight samples of radix paeoniae rubra were carried out by hpce under the following conditions: bared fused silica capillary (50 cm x 75 h m . ) , 30 mmol/l borate (ph = as buffer, the run voltage is +25 kv, detection wavelength of uv at 220 nm, and column temperature of 25 . result

4、sthe fingerprints were confirmed and compared by the software of the similarity evaluation system for chromatographic fingerprint. conclusionthe results showed that the method of hpce fingerprint is reliable and accurate to control the quality of two chinese traditional medicines.key words： radix pa

5、eoniae alba; radix paeoniae rubra; high performance capillary electrophoresis ; fingerprint赤芍为毛葭科芍药paeonia lactiflora pall.或川赤芍paeonia veitchii lynch.直接利用的干燥根，其味苦，微寒，归肝经，具有 清热凉血、散瘀止痛之功能。白芍为毛葭科芍药paeonia lacttiflora pall.水煮去皮后利用的干燥根，其味苦、酸，微寒，归肝、脾经， 具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗之功能lo两种药材中均含有 芍药甘、芍药内酯甘、苯甲酰芍药甘等单葩甘类和苯

6、甲酸、没食子酸 等酸类成份2, 3,其中总苜类物质为药材的要紧活性成份4,因 此2005版中国药典规定芍药苜的含量作为赤芍和白芍的质控指标。 可是赤芍和白芍的疗效和在临床利用上有专门大不同，仅利用单一成 份作为指标进行质量操纵，不能全面反映药材的有效成份，难以真正 全面地操纵药材的内在质量。中药指纹图谱是指中药材经适当处置后, 采纳必然的分析手腕，取得的能够标示该中药材及其制剂的各组分群 体特性的共有峰的图谱5o色谱指纹图谱是通过把复杂的化学成份 进行分离，形成高低不同的峰，组成一张色谱图，整个色谱图表达了 该样品所含化学成份的多少和量的大小，不仅可用于已知成份的分析, 还能够用于未知成份的分

7、析6。因此指纹图谱目前被国际上公以为 是植物药和中草药质量操纵最有效的工具之一 7,如美国草药典 (ahp)为五味子、甘草等热点植物药确信了比较稳固靠得住的tlc、 hplc分析结果和指纹图谱，为该类药材的生产和应用提供依据8。最近几年来，将色谱指纹图谱的方式用于赤芍和白芍研究的相关 文献也不断显现，但这些文献多利用高效液相色谱法(hplc)进行研 究912,如王巧等10利用hplc分析了三十多种赤芍和白芍药 材的醇提物,成立了白芍与赤芍的hplc指纹图谱分析方式。但用hplc 进行中药成份分析，运行本钱较高、分析时刻长，而且常碰到一些问 题，例如色谱柱易受污染，而且关于含极性成份较多的中药，

8、其“指 纹”的特点性不强。相较而言，高效毛细管电泳法(hpce)分析中药 那么有独特的优势，具有柱效高、快速、进样体积小，水溶性样品的 “指纹”特点性强，前处置简单，而且分析运行本钱低13, 14的 优势。关于赤芍或白芍hpce指纹图谱的研究未见报导，因此本文对赤 芍和白芍药材的hpce指纹图谱进行了探讨性研究，以期为有效操纵赤 芍和白芍药材质量提供新的方式。1仪器与试剂g1062a型hpce仪（美国agilent公司），配有二极管阵列检测器 （dad）；未涂层熔融石英毛细管（美国agilent公司），内径75 um, 有效长度50 cm； kq-400kde型高功率数控超声波仪（昆山市超声仪

9、器）； r201型旋转蒸发仪（上海申生科技）；fau04型电子天平（上海精天电 子仪器厂）o硼砂，无水乙醇，氢氧化钠均为分析纯，甲醇为色谱纯，实验用 水均为milli-q超纯水。芍药苜标准品（）购自中国药品生物制品检 定所，其他样品购自各药品公司，来源为全国各产地。2方式与结果标准溶液及供试品溶液的配制标准溶液的配制准确称量芍药在标准品，加入甲醇溶解定容， 用30 inmol/l的硼砂溶液稀释。进入hpce系统前经u m微孔滤膜过 滤。供试品溶液的制备将供试样品干燥后进行粉碎，过60目筛。准确称取粉碎后的样品g,置于100 ml具塞锥形瓶中，加入40 ml 95%乙醇，在35温度条件下超声辅助

10、提取30 min,提取液过滤，将滤液 在55条件下进行旋转蒸发浓缩至干，再加入30 mmol/l硼砂溶液20 ml溶解，过um微孔滤膜后作为供试品溶液。hpce i：作条件采纳压力进样方式，压力50 mbar,进样时刻3s, 分离电压25 kv,运行温度维持25,紫外检测波长220 nm,带宽8 nm, 参比波长500 nm,运行缓冲液为30 mmol/l的硼砂溶液（用氨水调ph 值至。试样进入毛细管前，均需过um微孔滤膜，分析开始前，依次 用1 mol/l naoh溶液，超纯水缓和冲液冲洗毛细管各5 min,分析进 程中，及时改换缓冲液瓶中的缓冲溶液，以保证两缓冲液瓶中缓冲液 组分一致，保证

11、分析精度。提取方式优化提取溶剂的选择依照2005版中国药典，对赤芍与白芍进行 辨别时，选用乙醇作为提取溶剂，对赤芍项下芍药昔进行含量测按时, 选用甲醇作为提取溶剂，而水煎提取是中草药传统提取方式，因此本 研究对不同溶剂（水、甲醇、乙醇）作提取溶剂时所取得的图谱进行 了比较。测定结果说明，以水为提取溶剂时，出峰数量少且各峰响应 值较低，不适于做指纹图谱；甲醇为提取溶剂时，提取结果与乙醇类 似，可是甲醇与乙醇相较，有较强的毒性，会对实验人员及环境造成 必然的危害；而用乙醇提取时，分离度较好，基线较平稳，适合做指 纹图谱，而且平安无害，因此选择乙醇做提取溶剂。可是由于乙醇与 缓冲盐溶液极性不同，对各

12、类化学成份的的溶解度也不相同，因此直 接将乙醇提取液进样检测时，色谱峰会显现较严峻的拖尾现象，而将 乙醇蒸干，以缓冲溶液从头溶解提取物再进样，能够解决那个问题， 取得峰形较好的色谱图。继续考察了 50%, 70%和95%3种不同浓度的乙醇作为提取溶剂取 得的提取结果。结果说明，以50%乙醇为提取溶剂时，分离度较差， 基线漂移严峻，以70%乙醇为提取溶剂时，基线也略有漂移，而以95% 乙醇为提取液时分离结果较为理想（见图13）。提取方式的选择比较了回流法和超声辅助提取法对样品进行提 取，结果显示，回流法与超声辅助提取法取得类似结果，可是回流法 操作复杂，处置时刻较长，旦加热进程可能会引发其它组分

13、的转变， 比较而言，超声法方便快速，提取效率较高，且结果良好，因此选用 超声法进行提取。hpce实验条件优化缓冲溶液性质对分离结果的阻碍hpce分离各类组分是利用电 泳的原理，但由于电渗的存在，又与传统的电泳不同，电渗确实是毛 细管中的溶剂因轴向直流电场作用而发生的定向流动，这种流动能够 实现所有样品组分的同向泳动，实现正负离子的同时分离，而hpce 运行中的缓冲溶液能够直接阻碍或改变电渗15,因此缓冲溶液的性 质会直接阻碍样品分离结果。依照文献报导，出于对药材中的成份进行质谱定性分析的期望, 本实验第一选择可进行质谱分析的碳酸铁和乙酸铁水溶液作为缓冲溶 液，可是结果说明碳酸筱水溶液和乙酸筱水

14、溶液作缓冲液时，样品响 应值低，分离度不高，取得的hpce谱图不适于作指纹图谱，而选择紫 外吸收比较低，ph缓冲范围比较宽的硼砂水溶液作为缓冲液时，那么 取得了较好的分离结果，因此确信硼砂溶液作为分离赤芍和白芍样品 的缓冲体系，并对其浓度和ph值的选择作了系统的考察。第一比较了 10, 20, 30和40 mmol/l的硼砂溶液作缓冲液时取 得的色谱图（见图47）,由图47能够看到，随着浓度的升高，样 品中各峰的保留时刻不同慢慢增大，分离成效也越好，但由于硼砂溶 液有较高的电导率，浓度太高时，会致使产生热量较多，无益于分离, 而且保留时刻太长，会延长每次进样分析的周期，因此选择30 mmol/

15、l 的硼砂溶液作为缓冲液，各峰取得较好的分离，且分析时刻较短。缓冲液的ph值操纵弱电解质样品的有效淌度、电渗乃至样品在 管壁上的吸附水平，因此对柱效和样品的分离度有显著的阻碍，本实 验比较了缓冲液ph值别离是，和时取得的分离结果（见图811）, 随着缓冲液的ph值慢慢升高，保留时刻变短，分离度显著提高，峰形 更好，因此本研究最终选择的硼砂溶液作为缓冲液。缓冲液中加入少量的有机溶剂常常能有效改善分离度，并使许多 水难溶的样品得以用毛细管电泳分析，因此本实验尝试在硼砂水溶液 中别离加入少量的甲醇和乙月青，可是结果只略阻碍响应值的大小，对 分离度并无显著阻碍，因此本研究只选用硼砂水溶液作缓冲液，不加

16、 任何有机添加剂。hpce电压和温度的选择本实验采纳刹时升压的恒压工作方式， 对不同的工作电压进行比较选择。在1530 kv的范围内，随着电压 的升高，分离效率升高，分离速度加速，但在较高的电压下，焦耳热 效应过大，致使峰形较差，噪音明显增大，无益于进行分析，因此选 择25 kv作为运行电压，在此条件下电流稳固，且能够取得较好的分 离结果。电泳温度的选择要紧指毛细管外表温度的选择与操纵，应该考虑 热效应操纵、重复性操纵、分离效率操纵和分离介质对温度的限制等 因素，同时受到仪器条件的阻碍。本实验考察了温度在1530c的范 围内取得的不同分离结果，温度太低时，分离效率不高，分离速度过 慢，而温度太

17、高时，热效应过大，也会阻碍分离结果，因此最终选择25作为电泳温度。检测波长的选择依照文献报导，利用hplc对赤芍或白芍样品进 行紫外检测时，多项选择用230 nm作为检测波长16, 17,故本实 验第一选择230 nm波长进行检测，结果发觉芍药苜响应值较大，而其 他成份响应值那么相对较低，致使谱图中出峰数量少，不适于作为表 现所有成份整体情形的指纹图谱。而通过度析一个样品提取物的三维- 紫外-毛细管电泳（3d-uv-ce）图，比较不同波长下的紫外吸收值的大 小，确信220 nm为检测波长时，取得的谱图较之其他检测波长基线平 稳，分离度较好，能够取得最正确的指纹图谱，因此最后选择220 nm 作

18、为检测波长。方式学考察色谱峰的定位本文要紧依照对照品的保留时刻对样品进行色谱 峰定性。芍药甘作为赤芍和白芍中的重要有效成份之一，在药材中含 量较高，而且药典规定以它作为赤芍和白芍的质控指标，因此本实验 选择芍药苜标准品对样品中的芍药首峰进行定性，并以此峰作为参照 峰。实验时以标准溶液和样品供试溶液按相同的条件进样分析，通过 对照取得的两份色谱图，并将其uv谱图与相应己知标准品图谱进行比 较印证，以确信与对照品相应的峰位，最终确认样品谱图中与标准品 谱图保留时刻相同的峰为芍药首峰（见图12）。a-标准品b-供试样品图12在相同条件下芍药件标准品的hpce色谱图和光谱图与供试样品的hpce色谱图周

19、密度实验按优化后的hpce工作条件，对一个赤芍样品供试品 溶液进行6次重复进样分析，测得谱图中芍药首峰的峰面积和保留时 刻，别离计算其标准误差，取得峰而积和保留时刻的rsd值别离是% 和 ,说明仪器周密度良好。重复性实验周密称取同一样品5份，别离按”项下处置方式 制成供试品溶液，然后依照 项下的hpce工作条件进样测定，测得 芍药首峰面积和保留时刻，并计算其标准误差，峰而积和保留时刻的 rsd值别离为和 ,说明该方式重复性良好。 稳固性实验将一个 赤芍样品的供试品溶液依照项下hpce工作条件，别离在0, 4, 6, 14, 20, 24h时进样测定，将一个白芍样品的供试品溶液按相同条件, 别离

20、在0, 2, 4, 8, 18, 24 h时进样测定，结果显示供试品溶液中芍 药汴在24 h内峰面积和保留时刻无明显转变，赤芍样品中峰面积和保 留时刻的rsd值别离为%和 ,白芍样品中峰面积和保留时刻的rsd 值别离为和 ,说明供试品溶液在24 h内化学性质稳固。不同药材样品指纹图谱的成立本文检测了经“”项下方式处置 的7个赤芍样品和8个白芍样品按项下hpce方式进样分析取得 的结果，每一个样品平行进样两次，取得色谱图。遵循成立hpce指纹 图谱的技术参数，成立赤芍和白芍样品的指纹图谱。指纹图谱中要紧特点峰的相对保留时刻或峰面积比值能较全面 地反映所含成份的相对关系，表现中药成份的复杂性和相关

21、性，有利 于更好地评判、操纵中药材及中药产品质量18。木文选择在所有赤 芍和白芍样品中均存在，且具有必然峰面积的芍药甘峰作为参照峰， 别离求出赤芍与白芍指纹图谱中各特点峰的相对保留时刻的平均值 （a）及相对标准误差（rsd%）和相对峰面积（结果见表12）。由 所得的相对保留时刻的数据能够判定标定，赤芍样品色谱指纹图谱中 共有10个共有峰，其峰面积总和占总峰面积的93%以上，其中3号峰 确以为芍药苜（见图13）；白芍样品色谱指纹图谱中共有15个共有峰, 其峰面积总和占总峰面积的97%以上，其中2号峰确以为芍药甘（见 图14）o表1赤芍hpce指纹图谱中共有峰的相对保留时刻和相对峰 面积表2白芍h

22、pce指纹图谱中共有峰的相对保留时刻和相对峰而积指纹图谱相似度分析指纹图谱反映的是样品整体的特点，进行 指纹图谱比较，能够反映样品之间的亲疏程度，可是单纯的直观比较 指纹图谱的峰的多少和峰的大小，带有个人的主观性。相似度能够定量的描述指纹图谱，本实验用相似度分析对样品进行了比较，能够定量的、客观的对样品进行评判9o相似度计算方式多有不同，有文献采纳excel软件，按相关系数 原理进行处置19,但大多采纳专门的相似度计算软件处置。本研究 采纳国家药典委员会推荐利用，由浙江大学制药工程研究所运算机辅 助中药分析实验室研发的“中药指纹图谱相似度计算软件” 20,以 夹角余弦作为相似度的评判指标，对测

23、定结果进行图谱比对，评判供 试样品指纹图谱与系统生成的对照指纹图谱（各样品谱图峰面积的平 均值）的相似性，对照共有图说别离计算取得赤芍和白芍药材提取物 的相似度。结果见表34。表3赤芍样品提取物指纹图谱相似性分析 结果表4白芍样品提取物指纹图谱相似性分析结果由表3中的数据, 能够看出各产地赤芍相似度一样。尽管由表1中的数据能够看出各赤 芍样品的谱图中各峰出峰时刻的相对标准误差很小，可是峰面积相差 较大，说明样品中的化学成份种类相仿，而各成份的含量不同，推测 可能是由于赤芍中的化学成份受各产地生长环境阻碍较大造成的。一样，由表4中的数据，能够看出除6号和8号样品，其他产地 的白芍样品相似度都较高

24、。由上可见，以芍药甘作为唯一指标，不能全面的反映赤芍和白芍 中所有成份的信息，难以真正操纵药材质量，指纹图谱能够弥补这一 缺点，全而反映药材的内在质量。而指纹图谱的相似度分析，又为这 种方式提供了定量分析的保证，从而对中药产品质量作出较全面、准 确的评判。3结论尽管药典中规定赤芍与白芍药材都以芍药营的含量作为质控指 标，可是两种药材疗效及临床应用相当不同，由本研究通过一系列条 件优化最终成立的hpce指纹图谱,那么能够看出二者的指纹图谱区别 明显，说明赤、白芍化学成份的种类与含量有明显不同，这点与其他 文献取得的结果相符，推测由指纹图谱所反映出的这些区别可能与其 临床疗效的不同有相关性。本文所

25、成立的赤、白芍hpce检测方式，前 处置便易操作，分析速度快，具有良好的重现性、稳固性，取得的结 果可用于二者的质量分析与评判。【参考文献】1国家药典委员会.中国药典，i部s.北京：化学工业 出版社，2005： 68, 109.2王朝虹，闵知大.芍药化学成份及药理研究j.时珍国医国药，1999, 10(7)： 544.3 ivanka n. kostova, mario f. simeonov, daniela i. todorova et al. petkova. two acylated monoterpene glucosides from paeonia peregina j. phytochemistry, 1998, 48(3)： 511.4马双成，邓少伟.赤芍总苜的生产工艺条件研究j.中 草药，1998, 29(10)： 664.5国家食物药品监督治理局.中药注射剂指纹图谱研究的技 术要求(暂行)的通知j.中成药，2000, 22(10)： 671.6罗国安，王义明.中药指纹图谱的分类和进展j.中国 新药杂志,2002, 11(1)： 46.7张克荣，毕开顺.赤芍h