关于“基因表达载体构建”的教学思考

1、关于“基因表达载体构建”的教学思考关于“基因表达载体构建”的教学思考江苏省南京市天印高级中学 倪同亮【摘 要】一个完整的基因表达载体上除了目的基因外，还必须有启动子、 终止子及标记基因等，如果目的基因自带启动子，是不是就不需要加启动子呢？ 构建基因表达载体时，用同一种限制酶酶切含目的基因的 dnat段和载体是不是 最佳选择？文章主要就这两点进行分析归纳， 旨在提高课堂授课效率，提升学生 的应试能力。【关键词】基因表达载体；限制酶；黏性末端；平末端；启动子；乳腺生物 反应器新课程实施已逾十年，伴随着教与学、学与考，高中生物课程知识体系及高 考的考察重点已趋于明朗化。如近几年全国各地高考卷频繁对选

2、修出”基因工 程”这一知识点进行考察，尤其对“基因表达载体的构建”这一核心步骤中所涉 及的诸多问题的考查可谓层出不穷。 本文从自身教学实践出发，认为应强化以下 两点的教学：一、关于启动子的选择构建基因表达载体的目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用， 所以在一个完整的基因 表达载体上除了目的基因外，还必须有启动子、终止子及标记基因等。一个基因 包含编码区和非编码区，启动子位于编码区上游非编码区序列， 它是rnair合酶 识别和结合部位，有了它才能驱动基因转录出mrna最终翻译获得所需要的蛋白质。那么，启动子的选择有要求吗？我们知道获取目

3、的基因的方法有从基因组文库中获取、有人工合成：如反转录法、pcr直接合成等。人工合成的目的基因往往不含启动子、终止子等，这 就必须在构建基因表达载体时加入启动子，否则转录无法启动。问题是加入的一 定是原目的基因中的启动子吗？另外，如果是从基因组文库中获取的目的基因是 含启动子的，那么，在构建基因表达载体时，是不是就无需加入启动子呢？人教版选修三现代生物科技专题第 21页在讲述动物基因工程应用前景 时，提到用转基因动物生产药物。将药物蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调 控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中，将受精卵 送入母体，使其发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，

4、可以通过分泌乳 汁生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器。请注意：基因表达载体上的启动子并不是药用蛋白基因自带的启动子， 而是乳腺蛋白基因的启动子，这也体现了有 些启动子具有特异性，如乳腺蛋白基因的启动子只会在乳腺细胞中启动基因的转 录，从而使得药用蛋白基因能在乳腺细胞中成功特异性表达，以此从乳汁中获得药用蛋白。二、关于限制酶的选择在构建基因表达载体时，其核心是将目的基因与载体结合，而结合是否符合 要求，限制酶的选择至关重要。限制酶的作用是识别双链dn砌子中特定的核昔 酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核甘酸之间的磷酸二酯键断开。dna经限制酶酶切产生的dna段通常有两种形式一一粘性末端和平

5、末端。人教版选修出教科书第 11页写到用同一种限制酶分别切割目的基因与载 体，因为切割后能产生相同的黏性末端，末端之间能发生碱基互补配对而形成重 组dn吩子，但此方法是最佳选择吗？结合近几年高考试题和教学实践，就限制酶选择的优缺点归纳如下：1 .单酶切的优缺点。如教材所述，用同一种限制酶分别切割含目的基因的 dnat段与载体。这是最易操作的一种方法，含目的基因的 dnat段与载体在同 种限制酶作用下会形成相同的黏性末端， 这两个黏性末端通过碱基间的互补配对 而连接，进而形成重组dn砌子，但存在着明显的缺点：酶切后的载体与目的 基因在dn啦接酶作用下会发生自身环化。原因是酶切后的目的基因和载体的

6、两 端各有一个黏性末端，这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基因和载体都会 发生首尾相连，从而形成环状dn砌子，甚至出现多个载体、多个目的基因连接 而成的环状dna子，这就加大了筛选的工作量。目的基因与载体的反向连接。 目的基因的插入是要有正确的方向才能正确表达，如果载体和目的基因的酶切使用的是同一种限制酶，那么，目的基因的插入有两种可能：一种是目的基因的最 前端刚好插在启动子下游，这样可以正确表达；另一种刚好相反，目的基因的末 端插在启动子的下游，目的基因则无法表达或表达错误。这两种重组dn的子，其中只有一种是我们所需要的，同样也加大了筛选的工作量。2 .多酶切的优缺点。用两种或两种以上的限

7、制酶去切割含目的基因的dna片段和载体，较常见的是用同一组两种限制酶去切割含目的基因的dnat段和载体，两者都会产生具有两种不同的黏性末端的 dnat段，黏性末端间通过碱基互 补配对从而形成重组dn6子。多酶切的优点是可以克服单酶切的两大缺点： 一是多酶切后目的基因与载体 的两侧的黏性末端不相同，因此不会发生自身环化现象。二是可实现目的基因与 载体的定向连接。如紧靠启动子下游的是 ecori位点，而bamhlb点在后面； 目的基因的前端是ecori位点，末端是bamh佗点，酶切之后插进去，就可以保证目的基因的前端刚好插到紧靠着启动子的下游，且只产生一种重组dna目的基因实现定向插入，这样就可以

8、正确表达。当然，多种酶酶切的缺点同样存在，用多种酶切割，由于每种限制酶的最适 作用条件往往不同，所以一般不能将两种酶放在同一环境中使用，而是要进行两次操作，需更换培养液，以保证酶的高效性。因此，使用多酶切的方法在实际操 作中较单酶切要复杂得多。3 .慎重选择切割出平末端的限制酶。如果备选的限制酶酶切产生的末端是平 末端，则可用相同或不同的限制酶分别切割含目的基因的dnat段和载体，因为即使是两个不同的平末端，在dna!接酶的作用下也可以任意连接。此方法的优 点不需要含目的基因的dnat段和载体具有相同的限制酶识别序列，减少了对载 体的挑选和改造的工作量。但在实践中，极少用平末端，因为平末端的连接效率 比较低，会也会出现目的基因一目的基因、 载体一载体的自身环化现象及目的基 因和载体的反向连接现象。一般只有在找不到合适切成黏性末端的酶切位点而有 平末端切口的情况下才使用。教师的教学是一个不断积累的过程， 积累来自于自身的学习、来自于高考试 题的感悟、来自于学生课堂的质疑我们不可一成不变地照本宣书， 而应该做 一个发现者、改革者，只有