生物化学合工大第二章蛋白质化学ppt课件

1、第六节第六节 蛋白质的三维构造蛋白质的三维构造 蛋白质分子的多肽链按一定方式折叠、环绕或组装成特有的空间构造，亦称高级构造。蛋白质的高级构造即蛋白质的构象。 构象是指一样构型的化合物中，与碳原子相连的各原子或取代构象是指一样构型的化合物中，与碳原子相连的各原子或取代基团在单键旋转时构成的相对空间排布。构象的改动不需求共价键基团在单键旋转时构成的相对空间排布。构象的改动不需求共价键的断裂和重新构成，只需单键的旋转即可构成新的构象。的断裂和重新构成，只需单键的旋转即可构成新的构象。酰胺平面与酰胺平面与-碳原子的二面角碳原子的二面角 和和 二面角二面角 两相邻酰胺平面之间，能以两相邻酰胺平面之间，能

2、以共同的共同的C为定点而旋转，绕为定点而旋转，绕C-N键旋转的角度称键旋转的角度称角，角，绕绕C-C键旋转的角度称键旋转的角度称角角。和和称作二面角，亦称构称作二面角，亦称构象角。象角。肽链的主链可看成是由被肽链的主链可看成是由被Ca隔开的许多平面组成的。隔开的许多平面组成的。N端C端现实上，一个天然蛋白质多态链在一定条件下只需一种或很现实上，一个天然蛋白质多态链在一定条件下只需一种或很少几种构象，而且相当稳定。少几种构象，而且相当稳定。维持蛋白质分子构象的作用力维持蛋白质分子构象的作用力离子键离子键氢键氢键范德华力范德华力疏水相互作用力疏水相互作用力一、蛋白质的二级构造一、蛋白质的二级构造

3、一二级构造的概念 蛋白质分子中某一段肽链的部分空间构造，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。主要的化学键：主要的化学键： 氢键氢键 1. a-螺旋螺旋(a-helix) 2. b-折叠折叠 (b-pleated sheet) 3. b-转角转角 (b-turn) 4. 无规卷曲无规卷曲 (nonregular coil)二二级构造单元的种类1 1绝大多数天然蛋白质绝大多数天然蛋白质都是右手螺旋。都是右手螺旋。2 2每隔每隔3.63.6个氨基酸残个氨基酸残基螺旋上升一圈；每圈基螺旋上升一圈；每圈间距间距0.54nm0.54nm，即每个氨，即每个氨基酸残基沿螺旋中

4、心轴基酸残基沿螺旋中心轴上升上升0.15nm0.15nm，旋转，旋转100100。-螺旋构造的主要特点：螺旋构造的主要特点：1.-1.-螺旋螺旋(-helix)(-helix)3 3每个氨基酸残基的每个氨基酸残基的N-HN-H都与前面都与前面C C端端第四个残基第四个残基C=OC=O构成氢构成氢键。键。 4)4)螺旋体中一切氨基酸残螺旋体中一切氨基酸残基侧链都伸向外侧；链中基侧链都伸向外侧；链中的全部的全部C=OC=O和和N-HN-H几乎都平几乎都平行于螺旋轴行于螺旋轴, ,氢键几乎平行氢键几乎平行于中心轴于中心轴; ; * * R R为为GlyGly时，由于时，由于CaCa上有上有2 2个氢

5、，使个氢，使Ca-CCa-C、Ca-NCa-N的转动的转动的自在度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大的自在度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大大降低。大降低。R R基大基大( (如如Ile)Ile)也不易构成也不易构成-螺旋。螺旋。* * - -螺旋遇到螺旋遇到ProPro就会被中断而拐弯，由于脯氨酸是亚就会被中断而拐弯，由于脯氨酸是亚氨基酸且有刚性的环状构造。氨基酸且有刚性的环状构造。 * * 带一样电荷的氨基酸残基延续出如今肽链上时，螺旋带一样电荷的氨基酸残基延续出如今肽链上时，螺旋的稳定性降低。的稳定性降低。侧链在侧链在a-a-螺旋构造的影响：螺旋构造的影响：* * R R基较小

6、基较小, ,且不带电荷的氨基酸利于且不带电荷的氨基酸利于-螺旋的构成螺旋的构成, ,如如多聚丙氨酸在多聚丙氨酸在pH7pH7的水溶液中自发卷曲成的水溶液中自发卷曲成-螺旋。螺旋。2.-2.-折叠折叠(-pleated sheet) (-pleated sheet) - -折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键结合而成的折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键结合而成的锯齿状片状构造。锯齿状片状构造。在在- -折叠中，折叠中，- -碳原子总是处于折叠的角上，氨碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的基酸的R R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为

7、基酸之间的轴心距为0.35nm 0.35nm 。0.7nm -折叠构造的氢键主要是由两条肽链之间构成的；也可折叠构造的氢键主要是由两条肽链之间构成的；也可以在同一肽链的不同部分之间构成。几乎一切肽键都参与以在同一肽链的不同部分之间构成。几乎一切肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。-折叠有两种类型。一种为平行式，即一切肽链的折叠有两种类型。一种为平行式，即一切肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。后者更为稳定。链的方向相反。后者更为稳定。3.-转角转角-turn 也称也

8、称-回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回折折180180，使得氨基酸残基的，使得氨基酸残基的C=OC=O与第四个残基的与第四个残基的N-HN-H构成构成氢键。第二个氨基酸通常是氢键。第二个氨基酸通常是propro。 - -转角都在蛋白转角都在蛋白质分子的外表，多数质分子的外表，多数为亲水氨基酸组成。为亲水氨基酸组成。4.无规那么卷曲无规那么卷曲non-regular coil 又称自在卷曲，是指没有一定规律的松散肽又称自在卷曲，是指没有一定规律的松散肽链构造，但是其构造是明确而稳定的，经常构成链构造，但是其构造是明确而稳定的，经常构成酶的功能部位。酶的功

9、能部位。 无规卷曲常出如今无规卷曲常出如今a-a-螺旋与螺旋与a-a-螺旋、螺旋、a-a-螺旋与螺旋与-折叠、折叠、 - -折叠与折叠与-折叠之间。折叠之间。它是构成蛋白质三级构造所必需的。它是构成蛋白质三级构造所必需的。二、蛋白质的超二级构造二、蛋白质的超二级构造一超二级构造的概念一超二级构造的概念 指蛋白质中相邻的二级构造单位指蛋白质中相邻的二级构造单位(即单个即单个-螺旋或螺旋或-转角转角)组合在一同，构成有规那组合在一同，构成有规那么的在空间上能辩认的二级构造组合体。么的在空间上能辩认的二级构造组合体。超二级构造在构造层次上高于二级构造，但超二级构造在构造层次上高于二级构造，但没有聚集

10、成具有功能的构造域。没有聚集成具有功能的构造域。二超二级构造的根本方式超二级构造类型超二级构造类型1 2 3 4 5 指多肽链在二级构造或超二级构造的根底上指多肽链在二级构造或超二级构造的根底上构成三级构造的部分折叠区，它是相对独立的严构成三级构造的部分折叠区，它是相对独立的严密球状实体，称为构造域密球状实体，称为构造域domaindomain。 酵母己糖激酶的三级构造构造域之间有一段柔性的肽链构造域之间有一段柔性的肽链相连相连铰链区，使构造域之间铰链区，使构造域之间可以发生相对挪动；构造域承可以发生相对挪动；构造域承当一定的生物学功能，几个构当一定的生物学功能，几个构造域协同作用可表达出蛋白

11、质造域协同作用可表达出蛋白质的总体功能；构造域间的裂痕的总体功能；构造域间的裂痕常为酶的活性部位，也是反响常为酶的活性部位，也是反响物的出入口。物的出入口。三、蛋白质的构造域三、蛋白质的构造域+构造域构造域乳酸脱氢酶构造域乳酸脱氢酶构造域1 /构造域构造域丙酮酸激酶构造域丙酮酸激酶构造域43-P-甘油醛脱氢酶构造域甘油醛脱氢酶构造域2木瓜蛋白酶构造域木瓜蛋白酶构造域1木瓜蛋白酶构造域木瓜蛋白酶构造域2无规那么卷曲无规那么卷曲+ -螺旋构造螺旋构造域域无规那么卷曲无规那么卷曲+-回折构造回折构造域域 三级构造三级构造tertiary structuretertiary structure：指的：

12、指的是多肽链在二级构造、超二级构造和构造域的是多肽链在二级构造、超二级构造和构造域的根底上，主链构象和侧链构象相互作用，进一根底上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠构成球状分子构造。步盘曲折叠构成球状分子构造。四、蛋白质的三级构造四、蛋白质的三级构造一三级构造的概念一三级构造的概念二球状蛋白的三级的构造特征二球状蛋白的三级的构造特征含有多种二级构造单元。含有多种二级构造单元。分子外表往往有一个内陷的空隙，它经常是蛋分子外表往往有一个内陷的空隙，它经常是蛋白质的活性中心。白质的活性中心。 大多数非极性侧链埋在分子内部，构成疏水核；大多数非极性侧链埋在分子内部，构成疏水核；而极性侧链在分

13、子外表，构成亲水面。而极性侧链在分子外表，构成亲水面。 蛋白质的三级构造具有明显的折叠层次。蛋白质的三级构造具有明显的折叠层次。 分子呈现球状或椭圆状。分子呈现球状或椭圆状。三维持三级构造的作用力三维持三级构造的作用力二硫键二硫键 共价键共价键 疏水作用疏水作用非共价键次级键非共价键次级键氢键氢键 离子键离子键范德华力范德华力 四级构造四级构造quaternary quaternary structurestructure：由两条或两：由两条或两条以上具有三级构造的多肽条以上具有三级构造的多肽链聚合而成、有特定三维构链聚合而成、有特定三维构造的蛋白质构象。每条多肽造的蛋白质构象。每条多肽链又称

14、为亚基链又称为亚基(subunit) (subunit) 。五、蛋白质的四级构造五、蛋白质的四级构造例例如如，血血红红蛋蛋白白的的四四级级构构造造一四级构造的概念一四级构造的概念二蛋白质四级构造的特点v 1 1有多个亚基有多个亚基v 2 2稳定性主要靠亚基间的疏水作用维持稳定性主要靠亚基间的疏水作用维持v 3 3亚基单独存在时无生物活性或活性很小，亚基单独存在时无生物活性或活性很小， v 只需经过亚基相互聚合成四级构造后，蛋只需经过亚基相互聚合成四级构造后，蛋v 白质才具有完好的生物活性。白质才具有完好的生物活性。 v 4 4亚基见具有协同性和别构效应。亚基见具有协同性和别构效应。 蛋蛋白白质

15、质的的空空间间构构造造二级构造二级构造超二级构造超二级构造构造域构造域三级构造三级构造四级构造四级构造六、蛋白质三维构造与功能的关系六、蛋白质三维构造与功能的关系一肌红蛋白与血红蛋白的构造一肌红蛋白与血红蛋白的构造 Hb与与Mb一样能可逆地与一样能可逆地与O2结合，结合， Hb与与O2结合后称为氧合结合后称为氧合Hb。氧合。氧合Hb占总占总Hb的百分数的百分数称百分饱和度随称百分饱和度随O2浓度变化而改动。浓度变化而改动。二血红蛋白的构象变化与结合氧二血红蛋白的构象变化与结合氧 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线1. 协同效应协同效应(cooperat

16、ivity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合才后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合才干的景象，称为协同效应。干的景象，称为协同效应。 假设是促进作用那么称为正协同效应假设是促进作用那么称为正协同效应 (positive cooperativity)(positive cooperativity)假设是抑制造用那么称为负协同效应假设是抑制造用那么称为负协同效应 (negative cooperativity)(negative cooperativity)O2血红素与氧结血红素与氧结合后，铁原子半径合后，铁

17、原子半径变小，就能进入卟变小，就能进入卟啉环的小孔中，继啉环的小孔中，继而引起肽链位置的而引起肽链位置的变动。变动。变构效应变构效应(allosteric effect)蛋白质空间构造的改动伴随其功能蛋白质空间构造的改动伴随其功能的变化，称为变构效应。的变化，称为变构效应。2. 波尔效应波尔效应Bohr 1904年，Christian Bohr发现： 添加CO2浓度、降低pH能显著降低血红蛋白与O2的结合。生理意义：波尔效应使血红蛋白运输生理意义：波尔效应使血红蛋白运输O2的效率提高。的效率提高。w2，3二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸BPG经过与血红蛋白的两经过与血红蛋白的两个个亚基构成盐键稳定了血

18、红蛋白的脱氧态构象，亚基构成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态构象，因此降低了血红蛋白的氧亲合力。因此降低了血红蛋白的氧亲合力。3. BPG的别构效应的别构效应三蛋白质构象改动与疾病三蛋白质构象改动与疾病 蛋白质构象疾病：假设蛋白质的折叠发蛋白质构象疾病：假设蛋白质的折叠发生错误，虽然其一级构造不变，但蛋白质的生错误，虽然其一级构造不变，但蛋白质的构象发生改动，仍可影响其功能，严重时可构象发生改动，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。导致疾病发生。蛋白质构象改动导致疾病的机理：有些蛋蛋白质构象改动导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常构成抗蛋白水解白质错误折叠后相互聚集，常构成抗蛋白水解酶

19、的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改动。为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改动。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改动疯牛病中的蛋白质构象改动疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成在某种未知蛋白质的作

20、用下可转变成全为全为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病第七节第七节 蛋白质的理化性质与分别纯化蛋白质的理化性质与分别纯化一、蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质一蛋白质的两性电离一蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶

21、液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的时溶液的pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小，在电场中不挪动。质的溶解度最小，在电场中不挪动。蛋白质的等离子点特征常数：指在纯水中即没有其它盐类存在蛋白质的正离子数等于负离子数的pH值。因蛋白质的等电点不是一成不变的，它随溶剂性质、离子强变等要素而改动。二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质 由于蛋白质分子量很大，在水溶液中构成由于蛋白质分子量很大，在水溶液中构成1-

22、100nm的颗的颗粒，因此具有胶体溶液的特征布郎运动、丁道尔景象、不粒，因此具有胶体溶液的特征布郎运动、丁道尔景象、不能透过半透膜。能透过半透膜。1. 1.蛋白质胶体稳定的要素蛋白质胶体稳定的要素可溶性蛋白质分子外表分布着大量极性氨基酸残基，可溶性蛋白质分子外表分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，经过水协作用在蛋白质颗粒外表对水有很高的亲和性，经过水协作用在蛋白质颗粒外表构成水化层，其可防止分子互碰而聚集构成水化层，其可防止分子互碰而聚集 ；蛋白质在非等电点形状时带同种电荷，在颗粒外表构蛋白质在非等电点形状时带同种电荷，在颗粒外表构成电荷层，同性电荷互斥，使分子不能聚集。成电荷层，同

23、性电荷互斥，使分子不能聚集。+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化层水化层+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用 蛋白质的聚沉蛋白质的聚沉蛋蛋白白质质胶胶体体溶溶液液沉沉淀淀作作用用表表示示图图 2. 2.蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用 假设参与适当的试剂使蛋白质分子处于等电点形状或假设参与适当的试剂使蛋白质分子处于等电点形状或失去水化层消除一样电荷，除去水膜，蛋白质胶体溶失去水化层消除一样电荷

24、，除去水膜，蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。液就不再稳定并将产生沉淀。 沉淀方法类别沉淀方法类别: : 高浓度中性盐盐析高浓度中性盐盐析 等电点沉淀等电点沉淀 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 重金属盐类沉淀重金属盐类沉淀 生物碱试剂和某些酸类沉淀生物碱试剂和某些酸类沉淀 加热变性沉淀加热变性沉淀 盐析盐析(salt precipitation)是将高浓度硫酸铵、硫酸钠是将高浓度硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等中性盐参与蛋白质溶液，使蛋白质外表水或氯化钠等中性盐参与蛋白质溶液，使蛋白质外表水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。*分段盐析：调理盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几分段盐析：

25、调理盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几 种蛋白质分段析出。种蛋白质分段析出。 例如：血清球蛋白例如：血清球蛋白50%(NH4)2SO4饱和度，饱和度， 清蛋白饱和清蛋白饱和(NH4)2SO4)。淀的蛋白质也未必都已变性。淀的蛋白质也未必都已变性。* 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白量变性后的絮状物加热可变成比较巩固蛋白量变性后的絮状物加热可变成比较巩固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 三蛋白质的变性与复性三蛋白质的变性与复性蛋白质在某些物理和化学要素作用下，其蛋白质在某些物理和化学要素作用下，其特定的空间

26、构象被破坏，也即有序的空间构造特定的空间构象被破坏，也即有序的空间构造变成无序的空间构造，从而导致其理化性质改变成无序的空间构造，从而导致其理化性质改动和生物活性的丧失。动和生物活性的丧失。1. 1.蛋白量变性的概念蛋白量变性的概念2. 2.变性的本质变性的本质 破坏非共价键，不改动蛋白质的一级构造。破坏非共价键，不改动蛋白质的一级构造。3.变性的要素变性的要素 加热、有机溶剂、强酸、强碱、外表活性剂加热、有机溶剂、强酸、强碱、外表活性剂 如十二烷基硫酸钠即如十二烷基硫酸钠即SDS、复原性试剂、复原性试剂 尿素、盐酸胍、紫外线、机械力等尿素、盐酸胍、紫外线、机械力等 。 4.变性蛋白质性质的改

27、动变性蛋白质性质的改动 生物学功能的丧失主要标志；生物学功能的丧失主要标志； 分子外形改动，肽链松散，反响基团添加，分子外形改动，肽链松散，反响基团添加，易被易被 酶消化；酶消化； 疏水基团外露，水化层被破坏，溶解度降疏水基团外露，水化层被破坏，溶解度降低，易低，易 构成沉淀析出，粘性添加，紫外吸收改构成沉淀析出，粘性添加，紫外吸收改动等；动等； 丧失结晶才干。丧失结晶才干。 运用举例运用举例临床医学上，变性要素常被运用来消毒及灭菌。临床医学上，变性要素常被运用来消毒及灭菌。此外此外, , 防止蛋白量变性也是有效保管蛋白质制防止蛋白量变性也是有效保管蛋白质制剂如疫苗等的必要条件。剂如疫苗等的必

28、要条件。 5.蛋白质的复性蛋白质的复性 假设蛋白量变性程度较轻，去除变性要素后，假设蛋白量变性程度较轻，去除变性要素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) ，这种变性也称为可逆变性。，这种变性也称为可逆变性。可逆变性作用可逆变性作用 蛋白质复性蛋白质复性尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇去除尿素、去除尿素、-巯基巯基乙醇乙醇非折叠形状，无活性非折叠形状，无活性天然形状，天然形状，有催化活性有催化活性四蛋白质的分子大小四蛋白质的分子大小蛋白质是分子量很大的

29、生物分子，相对分子质量大于6000，最高可达40000000烟草花叶病毒。目前常用的方法包括：分散系数、沉降超离心、凝胶过滤、浸透压、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。1.根据化学成分测定最小相对分子质量根据化学成分测定最小相对分子质量 利用化学分析定量测定蛋白质中某一特利用化学分析定量测定蛋白质中某一特殊元素的含量，并假定蛋白质分子中含殊元素的含量，并假定蛋白质分子中含1个个这种元素，即可测算最低这种元素，即可测算最低Mr。如：用化学分析法测定血红蛋白质中含如：用化学分析法测定血红蛋白质中含Fe 0.34，那么，那么 最低最低 Mr=55.84100/0.34=16700； 用其它方法测定，其实践用其它

30、方法测定，其实践Mr为为16700的的4倍，倍，由由 此可知，血红蛋白含有此可知，血红蛋白含有4个个Fe的原子，而不的原子，而不是是1 个个 Fe。2. 超离心法超离心法在在60 00080 000r/min 的高速离心力作用下，的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向挪动。蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向挪动。超离心法最为准确，但需昂贵的超速离心机。超离心法最为准确，但需昂贵的超速离心机。用光学方法测定界面挪动的速度即为蛋白质的用光学方法测定界面挪动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。离心沉降速度。蛋白质的沉降速度与分子大小和外形有关，由蛋白质的沉降速度与分子大小和外形有关，由于沉降

31、系数于沉降系数S大体上和分子量成正比关系，大体上和分子量成正比关系，故可运用超速离心法测定蛋白质分子量，但故可运用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子外形高度不对称的大多数纤维状蛋白对分子外形高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。质不适用。离离心心机机构构造造表表示示图图转头转头转头腔转头腔沉降样品沉降样品驱动马达驱动马达真空真空冷冻冷冻w沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。表示。w一个一个S单位，为单位，为110-13秒。秒。w相对分子质量越大，相对分子质量越大，S值越大。值越大。w蛋白质的沉降系数：蛋白质的沉降系数：1200S

32、。w超速离心法既可以用来测定蛋白质的分子量也可以用作分别超速离心法既可以用来测定蛋白质的分子量也可以用作分别纯化蛋白质。纯化蛋白质。s=v2x v =沉降速度dx/dt=离心机转子角速度弧度/s x =蛋白质界面中点与转子中心的间隔cmw由沉降系数由沉降系数S可根据斯维得贝格可根据斯维得贝格Svedberg方程方程计算蛋白质分子的相对分子质量：计算蛋白质分子的相对分子质量：w M=RST/D1iw R：气体常数：气体常数 T：绝对温度：绝对温度 w D：分散系数：分散系数 ：溶剂的密度：溶剂的密度3.凝胶过滤法凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状构造。凝胶过滤所用介质为凝胶珠，

33、其内部为多孔网状构造。一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子那么被排阻在外。子进入凝胶颗粒内部，大分子那么被排阻在外。洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状构造中穿来穿去，历程长，积小；小分子在颗粒网状构造中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。后洗脱下来，洗脱体积大。测定蛋白质分子量普通用葡聚糖，商品名：测定蛋白质分子量普通用葡聚糖，商品名：Sephadex洗脱体积：自参与样品开场到该组分的洗脱峰峰顶洗脱体积：自参与样品开场到该组分的

34、洗脱峰峰顶即搜集液中该组分浓度最大时出现时所流出的即搜集液中该组分浓度最大时出现时所流出的洗脱液体积。洗脱液体积。w测定样品蛋白质分子量的方法：测定样品蛋白质分子量的方法：w 测得几种规范蛋白质的洗脱体积测得几种规范蛋白质的洗脱体积Ve；w 以相对分子质量对数以相对分子质量对数logM对对Ve作图，作图， w 得规范曲线；得规范曲线；w 再测出未知样品洗脱体积再测出未知样品洗脱体积Ve；w 从规范曲线上可查出样品蛋白质的相对分从规范曲线上可查出样品蛋白质的相对分子子w 质量。质量。4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶：单体聚丙烯酰胺凝胶：单体丙烯酰胺丙烯酰胺acr

35、ylamide,简称简称Acr和交联剂和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺methylene-bisacrylamide,简称简称Bis在加速剂和催在加速剂和催化剂的作用下聚合而成的高分子物质，具化剂的作用下聚合而成的高分子物质，具有三维网状构造和分子筛性质。以此凝胶有三维网状构造和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis, 简称简称PAGE。 SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比

36、净电荷、大小、外形净电荷、大小、外形 此方法只能测得亚基肽链的相对分子质此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量量w方法：用方法：用SDS和巯基乙醇翻开二硫键处置和巯基乙醇翻开二硫键处置w 蛋白量变性肽链伸展并与蛋白量变性肽链伸展并与SDS结合，构成结合，构成w SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均带带 w 负电负电SDS带负电，且荷质比一样蛋白质带负电，且荷质比一样蛋白质分分w 子大，结合子大，结合SDS多；分子小，结合多；分子小，结合SDS少；少； w 不同蛋白质分子具有类似的构象。不同蛋白质分子具有类似的构象。 w 用几种规范蛋白质相对分子质量的对数值

37、对它们用几种规范蛋白质相对分子质量的对数值对它们w 的迁移率作图的迁移率作图 w 测出待测样品的迁移率测出待测样品的迁移率w 从规范曲线上查出样品的相对分子质量从规范曲线上查出样品的相对分子质量二、蛋白质的分别纯化二、蛋白质的分别纯化蛋白质分别纯化的普通原那么蛋白质分别纯化的普通原那么 提纯的目的：尽量提高蛋白质的纯度或比提纯的目的：尽量提高蛋白质的纯度或比活性，设法除去变性的和不需求的蛋白质，尽活性，设法除去变性的和不需求的蛋白质，尽能够提高蛋白质的产量。能够提高蛋白质的产量。根据蛋白质的性质加以选择，如分子大小，溶根据蛋白质的性质加以选择，如分子大小，溶 解度、电荷、吸附性质及生物亲和力等

38、。解度、电荷、吸附性质及生物亲和力等。普通程序：普通程序： 1、从组织细胞中溶解放出蛋白质，并坚持天、从组织细胞中溶解放出蛋白质，并坚持天然形状，常用低温冰冻、化学试剂及溶菌酶破然形状，常用低温冰冻、化学试剂及溶菌酶破壁、破膜，再用溶剂提取。壁、破膜，再用溶剂提取。 2、分别所需求蛋白质与其他蛋白质、分别所需求蛋白质与其他蛋白质 a 等电点沉淀等电点沉淀 b 盐析和有机溶剂分级分别盐析和有机溶剂分级分别 纯化：纯化：a 离子交换层析离子交换层析 b 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 c 亲和层亲和层 析析 d 电泳方法电泳方法 3、结晶提纯、结晶提纯 a 多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白多次结晶，除杂蛋白

39、和变性蛋白 b 结晶的最正确条件：略过饱和溶液结晶的最正确条件：略过饱和溶液 各步骤要求条件温暖，并加少量杀菌剂。各步骤要求条件温暖，并加少量杀菌剂。 防止蛋白量变性、蛋白质酶作用及微生物污染。防止蛋白量变性、蛋白质酶作用及微生物污染。一根据分子大小不同的分别方法1.透析和超越滤透析：根据的是蛋白质不能经过半透膜的性质，而水和无机盐等小分子自在经过，此方法只能将蛋白质和小分子物质分开，不能将不同蛋白质分开。超越滤：是利用外加压或离心使水和其他分经过半透膜，蛋白质留在膜上。透析与超越滤简易安装透析与超越滤简易安装2.密度梯度离心a.蛋白质颗粒沉降不仅决议于它的大小也取决于它的密度。b.颗粒沉降到

40、与本身密度相等的介质梯度时，即停顿不前。c.在离心力的作用下，各种蛋白质在不同密度介质中构成独立的区带。3. 凝胶过滤凝胶过滤a.又称分子筛层析，是根据分子大小分别蛋白质又称分子筛层析，是根据分子大小分别蛋白质 混合物最有效的方法之一。混合物最有效的方法之一。b.常用葡聚糖凝胶商品名为常用葡聚糖凝胶商品名为Sephadex)和琼脂糖凝和琼脂糖凝 胶商品名为胶商品名为Sepharose。c.网孔大小网孔大小用交联剂与葡聚糖或琼脂糖的比用交联剂与葡聚糖或琼脂糖的比 例来实现例来实现d.大分子先洗脱下来，小分子后洗下来。大分子先洗脱下来，小分子后洗下来。二利用溶解度差别的分别方法1.等电点沉淀利用各

41、种蛋白质在等电点时，溶解度最小这一性质，可以经过调理蛋白质溶液的PH值，将不同的蛋白质分开。2. 盐溶和盐析盐溶和盐析 盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子外表构成双盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子外表构成双电层，电层， 使蛋白质溶解度添加；使蛋白质溶解度添加； 盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子外表的水盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子外表的水化层，化层， 使蛋白质溶解度降低，发生沉淀析出。使蛋白质溶解度降低，发生沉淀析出。 分段盐析：不同蛋白质盐析所需的盐浓度不同，分段盐析：不同蛋白质盐析所需的盐浓度不同，蛋白质溶液中，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先蛋白质溶液中，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析

42、出，称分段盐析。后析出，称分段盐析。3.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 a 有机溶剂与水相溶争取蛋白质颗粒有机溶剂与水相溶争取蛋白质颗粒上的水上的水 膜，使之沉淀。膜，使之沉淀。 b 有机溶剂：乙醇、丙酮有机溶剂：乙醇、丙酮 c 低温操作，边参与边搅拌，防止部分过低温操作，边参与边搅拌，防止部分过热，引热，引 起变性，尽量缩短处置时间。起变性，尽量缩短处置时间。三根据电荷不同的分别方法三根据电荷不同的分别方法 1 . 电泳电泳 原理与原理与AA的电泳一样的电泳一样 电泳：带电颗粒在电场中挪动的景象。分子大电泳：带电颗粒在电场中挪动的景象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不小不同的蛋

43、白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以分开。同，在电泳时可以分开。 a. 自在界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进展电泳。自在界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进展电泳。 b. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进物上进 行电泳，不同组分构成带状区域。行电泳，不同组分构成带状区域。 1纸电泳：用滤纸作支持物。纸电泳：用滤纸作支持物。 2凝胶电泳：用凝胶淀粉、琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳：用凝胶淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺作酰胺作 支持物。支持物。 1圆盘电泳：玻璃管中进展的凝胶电泳。圆盘电泳：玻璃管中进展的凝胶电泳。2平板电泳：铺有凝胶的平板上进展的电泳。平板电泳：铺有凝胶的平板上进展的电泳。+-+ 纯化中运用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和纯化中运用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯化、制备蛋白质。检验方