瘀胆血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

1、瘀胆血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究 11-04-12 13:57:00 编辑：studa20 作者：钟晓琳，万居易，王忠琼，李昌平，胡莲【摘要】 目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导其分化为肝细胞的可行性。方法 分离、纯化并鉴定大鼠骨髓MSCs，制备正常及瘀胆大鼠血清，取第3代MSCs分组培养：A组：DMEM+10%FBS;B组：肝细胞生长培养基(HGM)+5%FBS; C组：HGM+5%正常大鼠血清;D组：HGM +5%瘀胆大鼠血清;E组：HGM +5%瘀胆大鼠血清+25g/L HGF。观察各组细胞形态变化，MTT法测定细胞生长曲线，采用RT-PCR检测甲胎蛋白

2、(AFP)和细胞角蛋白18(CK18)的表达，溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白(ALB)的含量。结果 培养过程中，D、E组出现多角形及双核细胞，A、B、C组细胞形态无明显变化。生长曲线显示细胞生长速度C组最快，D、E组均较B组快(P0.05)。D、E组于诱导第7，14天出现AFP mRNA阳性表达，第14，21天出现CK18 mRNA阳性表达，D、E组上清液中白蛋白浓度随诱导时间延长逐渐升高，且E组高于D组(P0.05)。A、B、C组未见AFP、CK18表达及白蛋白浓度变化。结论 正常大鼠血清能明显促进MSCs的增殖;瘀胆血清对MSCs有一定促增殖作用，且能有效诱导其向肝细胞分化，联合使用HGF能

3、提高分化率。 【关键词】 瘀胆血清;肝细胞生长因子;间充质干细胞;肝细胞Research on the Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Induced by Chelestatic Sera in vitro into HepatocyteZhong Xiaolin, Wan Juyi, Wang Zhongqiong, Li Cangping, Hu Lian, the Affiliated Hospital to Luzhou Medical Colleg, Luzhou City, Sichuan Province 646000 P.R

4、.ChinaAbstract Objective To discuss the possibility of the differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) induced by chelestatic sera in vitro into hepatocyte. Methods Rat bone marrow MSCs were isolated, purified and identified; normal and cholestatic sera of rats were prepared; the 3rd-passage MS

5、Cs were divided into groups for culture: Group A (DMEM+10%FBS), Group B (hepatocyte growth medium(HGM)+5%FBS), Group C (HGM+5% normal rat sera), Group D (HGM+5% cholestatic rat sera) and Group E (HGM+5% cholestatic rat sera+25 g/L HGF); The morphologic changes of the induced cells were observed and

6、the cell growth curve was measured with MTT assay; the expression of alpha-fetoprotein (AFP) and cytokeratin 18 (CK18) were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and the albumin content in supernatant was determined by bromocresol green method.Result MSCs polygonal and

7、 binuclear cells were observed in Group D and Group E in the culture process ; no obvious morphologic changes of the cells were observed in Group A, Group B and Group C; the cell growth curve demonstrated that the cells in Group C proliferated the fastest and those in Group D and Group E proliferate

8、d faster than those in Group B (P0.05); the positive expression of AFP m RNA was found in Group D and Group E on the 7th and 14th day after induction while the positive expression of CK18 mRNA was found on the 14th and 21st day, the albumin concentration in these 2 groups increased along with the ti

9、me length of induction, and the concentration in Group E was higher than that in Group D (P0.05); no expression of AFP and CK18 and no albumin concentration changes were observed in Group A, Group B and Group C.Conclusions Normal rat sera can obviously promote the proliferation of MSCs; cholestatic

10、sera is of certain effect in MSCs proliferation and can effectively induce the differentiation of MSCs into hepatocytes, the combined application with HGF can raise the differentiation rate.KEYWORDS cholestatic sera hepatocyte growth factor (HGF) mesenchymal stem cells (MSCs)hepatocyte近年来的研究表明，骨髓间充质

11、干细胞(Mesenchymal stem cell，MSCs)在一定条件下能分化为肝细胞1，这为临床上解决肝细胞移植、生物人工肝等的肝源短缺问题提供了新的思路2，但MSCs的分化方向受周围环境多种因素影响和决定，寻求适合MSCs增殖及向肝细胞定向分化的条件是目前尚需解决的重要问题。本研究采用含正常大鼠血清、瘀胆血清及肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)等成分的肝细胞培养基体外培养或诱导MSCs向肝细胞分化，并评价其扩增、分化能力及效果。1 材料与方法1.1 实验动物 810周龄清洁级健康雌性Wistar大鼠，体重约120g，用于提取骨髓细胞;清洁级健康Wi

12、star大鼠40只，雌雄不拘，体重为200260g，用于动物实验，提取血清;均由泸州医学院动物实验中心提供。1.2 主要试剂与仪器 低糖DMEM培养基(DMEM-LG)、FBS、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(Gibco公司，美国);肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)(R&D公司，美国);RNA提取试剂盒(上海华舜生物工程有限公司);RNA-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司);恒温CO2培养箱、生物安全柜(Thermo公司，美国);倒置荧光显微镜、倒置相差显微镜(Olympus公司，日本);酶标仪(Bio-Rad公司，美国)PCR扩增仪(PE公司，美国)

13、。1.3 MSCs的分离、纯化与鉴定 在无菌条件下取810周龄Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓细胞，采用Ficoll液密度梯度离心后，以2106/ml的密度接种，72h后首次换液，细胞融合达80%后按1 : 23传代纯化，传代时严格控制消化酶的量和消化时间，取第3代MSCs用于分化及鉴定。1.4 MSCs的诱导培养1.4.1 制备大鼠血清 取健康Wistar大鼠40只，随机分组：(1)正常组：禁食8h后，用3%巴比妥钠10ml/kg腹腔注射麻醉后，无菌心脏取血。(2)瘀胆组：同前禁食、麻醉后，结扎胆总管建立瘀胆模型，7d后无菌心脏取血。全血在37恒温箱内静置1h，4冰箱过夜，以2000r/min

14、离心20min，吸取上层血清，过滤除菌，56中灭活30 min。1.4.2 肝细胞生长培养基(hepatocyte growth medium,HGM)成分 DMEM-LG、5% FBS、地塞米松10-7 mmol/L、羟乙基哌嗪乙磺酸20 mmol/L、葡萄糖1 g/L、半乳糖 2 g/L、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠10 ml/L、维生素C 1 mmol/L、谷氨酰胺 0.73 g/L。1.4.3 实验分组 取第3代(passage 3，P3)MSCs按以下分组加入培养液诱导培养： A组：空白对照组，DMEM+10%FBS;B组：HGM+5%FBS;C组：HGM+5%的正常大鼠血清;D组：H

15、GM +5%瘀胆大鼠血清;E组：HGM +5%瘀胆大鼠血清+25ng/ml肝细胞生长因子;每3天全量换液1次，诱导培养21天。1.4.4 MTT法绘制细胞生长曲线 取P3 MSCs按3104/ml密度接种于96孔培养板，每孔100 ul，预留空白对照组后，按以上分组培养，在培养的第07天，每组取3孔细胞加入MTT 10 ul，4h后，吸取培养液加入DMSO 50 ul，在微型振荡器振荡5min后，用酶标仪测出在波长为490nm对应的OD值，每组取平均值绘制生长曲线。1.5 诱导后细胞检测1.5.1 形态学观察 倒置相差显微镜下观察诱导分化过程中细胞胞体大小、形态、核仁数目及核浆比例的变化。1.

16、5.2 甲胎蛋白(AFP)表达的检测 取诱导第0，7，14，21天的各组细胞分别提取RNA后用RT-PCR法检测各组细胞AFP mRNA的表达情况(正义：5-AACAGCAGAGTGCTGCAAAC-3，反义：5-AGGTTTCGTCCCTCAGAAAG- 3)。1.5.3 细胞角蛋白(CK18)表达的检测 取诱导第0，7，14，21天的各组细胞分别提取RNA后用RT-PCR法检测各组细胞CK18 mRNA的表达情况(正义：5-GGACCTCAGCAAGATCATGGC-3，反义：5-CCACGATCTTACGGGTAGTTG-3)。1.5.4 白蛋白合成能力检测 诱导后每3天收集各组培养细胞

17、上清液，用溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白浓度。1.6 统计分析 采用SPSS13.0统计软件包进行分析，计量资料以均数标准差(s)表示，不同时间点、不同组之间的比较采用重复测量资料的方差分析，计数资料采用秩和检验，以=0.05为检验水准，P0.05为有统计学意义。2 结 果2.1 MSCs的分离、纯化与鉴定 接种后46 h可见部分细胞贴壁，72 h可见集落形成，原代细胞形态多样，经传代培养后细胞纯度不断提高， P3细胞形态均一，呈梭形或纺锤形细胞，呈漩涡状或平行状排列(图12)。经成骨诱导14d后，改良钙钴法碱性磷酸酶染色阳性，成脂诱导14d后，油红O染色呈阳性，经免疫荧光染色见CD44、CD9

18、0染色呈阳性，CD45染色呈阴性反应。2.2 诱导各组细胞生长曲线的测定 按酶标仪测得OD值绘制生长曲线可见B组OD值于各时间点明显低于A组，差异有统计学意义(P0.05)，提示HGM抑制细胞生长;C组各时间点OD值均高于A、B组，差异有统计学意义(P0.05)，提示正常大鼠血清有明显促生长作用;D、E组OD值均高于B组，差异有统计学意义(P0.05)，提示二者促生长作用无明显差异。2.3 诱导后细胞的观察与检测2.3.1 形态学观察 A、B、C组细胞形态无明显变化，保持均一的长梭形，细胞逐渐密集，出现接触抑制。D、E组细胞约6d后，出现上皮样细胞，呈三角形或不规则形，8d左右可见少量细胞分化

19、为多角形的肝细胞样形态，胞浆丰富、核大，甚至出现双核细胞，14d后这类细胞明显增多(图3)。2.3.2 AFP表达的检测结果 D、E组于诱导第7、14天可见AFP mRNA的表达，通过灰度分析，可见随诱导时间延长AFP mRNA表达量逐渐降低，同一时间点，E组灰度值高于D组(图4，5)，A、B、C组未见AFP mRNA的表达。2.3.3 CK18 表达的检测结果 D、E组于诱导第14、21天出现CK18mRNA的表达，通过灰度分析，可见随诱导时间延长表达量逐渐增高，同一时间点，E组灰度值高于D组(图6，7)，A、B、C组未见CK18 mRNA的表达。图1 MSCs原代培养72h(40) 图2 P3 MSCs培养4 d (40) 图3 诱导分化14d(100) 图4 诱导分化7d AFP的表达情况 图5 诱导分化14d AFP的表达情况 图6 诱导分化14d CK18的表达情况 图7 诱导分化21d CK18的表达情况Fig.1 primary culture of MSCs at the 72nd hour (40) Fig.2 passage 3 MSCs on the 4th day (40) Fig.3 cell differentiation on the