反义硫代寡脱氧核苷酸抑制裸鼠人胆管癌生长的研究

1、反义硫代寡脱氧核苷酸抑制裸鼠人胆管癌生长的研究【摘要】目的观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)反义硫代寡脱氧核苷酸(ASPODN)对裸鼠人胆管癌血管生成和生长的抑制作用。方法传代培养的胆管癌细胞系QBC939，以5106个细胞/ml接种于裸鼠颈背部皮下，自48 h始局部注射ASPODN和等量的PBS，触及肿瘤结节后测量肿块的重量、成瘤率；彩色多普勒能量(CDE)检测转移瘤内新生血管的数目和分布；SLAB法免疫组化染色检测转移瘤中微血管密度(MCD)。结果局部注射ASPODN组，裸鼠胆管癌瘤重及MCD平均值分别为(26.908.4

2、2) g和0.680.16，PBS对照组为(49.3612.38) g和26.908.42(P0.01)；局部注射ASPODN组，转移瘤内用CDE动态检测到的血管数目及血流丰富程度明显少于PBS组(P0.01)。CDE丰富程度与对应切片上MCD的分布基本相符并且成正相关(P0.05)。结论VEGF ASPODN有明显抑制裸鼠胆管癌血管生成和生长的作用。【关键词】反义硫代寡脱氧核苷酸；裸鼠人胆管癌；血管生成；生长 Inhibition of growth of human cholangiocarcinoma in nude mice by vascular endthelial frowth

3、factor antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotidesCHEN Rufu*, SUN Hongwu, ZOU Qian, et al.（*Department of General Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030,China【Abstract】 Objective To study the inhibitory effect of vascular endothelial growth factor antisense phosphorot

4、hioate oligodeoxynucleotides (VEGF ASPODN) on growth and angiogenesis of human cholangiocarcinoma in nude mice, investigate the probability of ASPODN as a new drug against angiogenesis. Methods5106/ml QBC939 cells were inoculated subcutaneously to 20 nude mice which were randomly divided into 2 grou

5、ps. From the 2nd day, ASPODN and PBS were given respectively. The weight of the subcutaneous tumors was measured, and the number and distribution of angiogenesis were detected by color Doppler energy (CDE) and immunohistochemical staining. Results The tumor weight and the mean MCD value in the chola

6、ngiocarcinoma in ASPODN group were (26.908.42) g and 0.680.16, and (49.3612.38) g and 3.360.84 in PBS control group, respectively (P0.01). The number of angiogenesis and blood flow in the metastatic tumors observed under CDE in ASPODN group were less than in the PBS group (P0.01). The blood flow und

7、er CDE was basically agreement with the distribution of MCD in the corresponding sections (P0.05). Conclusion The growth and angiogenesis of human cholangiocarcinoma in nude mice can be inhibited by VEGF ASPODN.【Key words】 ASPODN；Human cholangiocarcinoma,nude mice；Angiogenesis；Growth为了探讨肿瘤血管生成反义基因治疗

8、在人胆管癌治疗中的作用，我们通过裸鼠人胆管癌转移瘤模型检测反义硫代寡脱氧核苷酸(ASPODN)对人胆管癌血管生成和生长的抑制作用，现报道如下。材料和方法1.裸鼠人胆管癌模型的制备及分组：将胆管癌细胞QBC939(第三军医大学王曙光教授提供1)制成单细胞悬液，接种在裸鼠(BALB/C，nu/nu裸小鼠，鼠龄34 周，体重2025 g，由北京市肿瘤研究所提供)颈部皮下，每只2106个细胞/0.2 ml。34 周后皮下肿瘤开始形成，68 周瘤体可达到23 cm3大小。裸鼠12只，随机分为2组：(1)ASPODN治疗组在接种QBC939后的第2 d，在裸鼠颈部皮下肿瘤细胞接种区缓慢注射ASPODN，每

9、只200 mg/L，每周2次，连续用3 周；(2)PBS实验对照组。触及肿瘤后，每3天测肿瘤长轴(L)、短轴(W)。根据公式V=1/2LW2计算肿瘤的体积，35 d后处死裸鼠，称其瘤重，一部分肿瘤组织用10%福马林固定，切成4 m厚切片，其余肿瘤组织在液氮中储存，备用。2.试剂及仪器：ASPODN由上海生工生物公司合成，ASPODN序列为5-GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC-3。AMV逆转录酶和Taq DNA合成酶购自Promega公司，鼠抗人因子相关抗原(FR Ag)单克隆抗体(Dako公司)，LSAB kit(Dako公司)，PCR扩增仪为美国产PTC-150-160型。3.F

10、R测定：采用LSAB法，DAB显色。用肝癌组织作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。4.转移瘤内血管丰富程度及频谱测定：采用彩色多普勒能量(CDE)。先用二维超声显像，观察肿瘤的大小，再用CDE测定肿瘤内的血流丰富程度和频谱。5.结果判定标准：MVD记数参照Veider Maeda2方法，记录5个视野内微血管数，取其平均数作为该病例MVD值。CDE血流分为4级3。0级：无血流信号；1级：有12个稳定的星点状血流信号；2级可见1条主要血管，其长度超过病灶的半径或见几条小血管；3级可见4条以上血管，或血管相互连通，交织成网状。6.统计学方法：t检验、2检验。结果1.ASPODN对裸鼠胆管癌转移瘤

11、内血管生成的影响：局部注射ASPODN组，MCD平均值为26.908.42，PBS组为49.3612.38，两组间差异有显著性(P0.01)。2.ASPODN对裸鼠胆管癌转移瘤的抑制作用：局部注射ASPODN组，裸鼠胆管癌转移瘤生长速度及瘤重明显低于PBS对照组，PBS组平均胆管癌细胞接种第22 d触及肿瘤，而ASPODN组平均为36 d。实验组肿瘤成瘤率也明显低于PBS对照组(P0.01)，见表1。3.转移瘤内血管丰富程度及频谱检测：ASPODN治疗组，CDE检测结果为转移瘤的体积缩小，肿瘤血管的数目明显减少，收缩期流速峰值(频谱)低于PBS对照组，见表2。表1ASPODN对裸鼠人胆管癌生长

12、的抑制作用(s)组别成瘤率(%)肿瘤重量(g)抑制率(%)ASPODN组83.30.680.1683.3PBS对照组100.03.360.840.0 注：与对照组比较，P0.01表2CDE检测裸鼠转移瘤内血流及频谱结果组别CDE频谱ps(cm/s)0123ASPODN组420012.00PBS对照组002445.60 注：与对照组比较，P0.014.转移瘤中MCD与CDE的相关性：CDE丰富程度与对应切片上MCD的分布基本相符，并且MCD与CDE分布成正相关(P0.05)。讨论本实验结果显示，ASPODN局部注射对胆管癌的血管生成具有明显的抑制作用，MCD平均值明显少于对照组。我们在本实验中应

13、用ASPODN局部注射使胆管癌的生长受到抑制，表现为成瘤的潜伏期延长，成瘤率低，瘤重较轻(P0.01)。但ASPODN未能完全抑制肿瘤的生长，说明尚需进一步了解剂量-效应关系以及时间-效应关系。未加修饰的ASODN抑制时间仅维持72 h，这可能与ASODN进入细胞较难和易被培养基及细胞内核酸酶降解所致。ASPODN具有良好的越膜性和对内外源性核酸的降解具有很强的耐力，因而ASPODN具有较强的效果，小剂量的ASPODN可获得长期的抑制肿瘤细胞生长的作用。即使我们应用的寡核苷酸经过结构修饰，使其对核酸酶的抗性增强，但其体内活性的维持仍然是较为短暂，其作用的维持不超过7 d，而且由于肿瘤血管生成有多种因素的参与，使VEGF反义寡核苷酸的抑制肿瘤生长仅呈现有限的作用。作者单位：陈汝福（430030武汉，同济医科大学附属同济医院普外科）邹倩（430030武汉，同济医科大学附属同济医院普外科）邹声泉（430030武汉，同济医科大学附属同济医院普外科）孙宏武（湖北大冶特钢集团公司医院外科）参考文献1王曙光，韩本立，段恒春，等.肝外胆管癌细胞系的建立.中华实验外科杂志，1997，17：245-246.2Maeda K, Chuhg YS, Oga WA, et al. Prognostic value of vascular entdothelial growth fac