毛细管色谱法3

1、 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作 用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现 象，称之为象，称之为电泳电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁 移速率不同，可实现分离。移速率不同，可实现分离。 l 1940年，年， Tiselius，瑞典，瑞典) 将蛋白质混合液放在将蛋白质混合液放在 两段缓冲溶液之间，两段缓冲溶液之间， 两端施以电压进行自两端施以电压进行自 由溶液电泳，第一次由溶液电泳，第一次 将人血清提取的蛋白将人血清提取的蛋

2、白 质混合液分离出白蛋质混合液分离出白蛋 白和白和、球蛋白；球蛋白； 发现样品的迁移速度发现样品的迁移速度 和方向由其电荷和淌和方向由其电荷和淌 度决定；度决定； l 第一次的自由溶液第一次的自由溶液 电泳；第一台电泳仪；电泳；第一台电泳仪； l 1948年，获诺贝尔年，获诺贝尔 化学奖。化学奖。 (19021971) 利用利用电泳电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方 法和技术叫法和技术叫电泳法电泳法或或电泳技术电泳技术。 按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、 自由电泳； 传统电泳分析：操作

3、烦琐，分离效率低，定量困难，无 法与其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75微米内径石英毛细 管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根 本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分 析技术高效毛细管电泳高效毛细管电泳。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减 小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小， 柱长增加， 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔 板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。 1980198519901995200020052010 0 2000 4000 6

4、000 8000 10000 12000 the number of articles Year 电场作用下，毛细 管柱中出现：电泳现电泳现 象和电渗流现象象和电渗流现象。 带电粒子的带电粒子的迁移速度迁移速度= =电泳电泳+ +电渗流；电渗流；两种速度的矢量和两种速度的矢量和。 正离子正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子阴离子：两种效应的运动方向相反两种效应的运动方向相反。 1.1.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管

5、、检测器、溶液瓶 2.2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分 离了24种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔板数； 3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行； 4.4.应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等； 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有 不同的迁移速度，不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？迁移速度与哪些因素有关？ 当带电离子以速度当带电离子

6、以速度 在电场中移动时，受到大小相等、在电场中移动时，受到大小相等、 方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。 电场力：电场力：FE = qE 阻阻 力：力：F = f 故：故： qE = f q离子所带的有效电荷； E 电场强度；离子在电场中的迁移速度； f 平动摩擦系数 ( 对于球形离子： f =6； 离子的表观液态动力学半径； 介质的粘度； ) 所以，迁移速度：所以，迁移速度： E q f qE 6 （球形离子） 物质离子在电场中物质离子在电场中差速迁移差速迁移是电泳分离的基础。是电泳分离的基础。 淌度淌度 ：单位电场强度下的平均电泳速度。：单

7、位电场强度下的平均电泳速度。 6 q E 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电 荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液- -固界固界 面形成双电层，二者之间存在电位差。面形成双电层，二者之间存在电位差。 当液体两端施加电压时，就当液体两端施加电压时，就 会发生液体相对于固体表面的移会发生液体相对于固体表面的移 动，这种液体相对于固体表面的动，这种液体相对于固体表面的 移动的现象叫移动的现象叫电渗现象电渗现象。 电渗现象中整体移动着的液电渗现象中整体移动着的液 体叫体叫电渗流电渗流（

8、electroosmotic flow ， 简称简称EOF）。）。 在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴 极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中 的溶液整体向负极移动，速度的溶液整体向负极移动，速度电渗流 电渗流。 。 电渗流的大小用电渗流速度电渗流的大小用电渗流速度电渗流 电渗流表示，取决于电渗淌 表示，取决于电渗淌 度度和电场强度和电场强度E E。即。即 EOF EOF = = EOF E E 电渗淌度取决于电泳介质及双电层的电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta

9、Zeta电势，即电势，即 EOF = = 0 0/ 0真空介电常数；介电常数；毛细管壁的Zeta电势。 EOF EOF = = 0 0 E/E/ 实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 EOF EOF = = L Lef ef/t /teo eo Lef 毛细管有效长度； teo电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳

10、极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极； 改变电渗流方向的方法：改变电渗流方向的方法： （1 1）毛细管改性）毛细管改性 表面键合阳离子基团； （2 2）加电渗流反转剂）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细 管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5 57 7倍；倍； 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： + + = =EOF EOF + + 阳离子运动方向

11、与电渗流一致； 阳离子运动方向与电渗流一致； - - = =EOF EOF - - 阴离子运动方向与电渗流相反； 阴离子运动方向与电渗流相反； 0 0 = =EOF EOF 中性粒子运动方向与电渗流一致；中性粒子运动方向与电渗流一致； （1 1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离； （2 2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如 同改变同改变LCLC中的流速；中的流速； （3 3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；）电渗流的微小变化影响结果的重现性； 在在HPCEHPCE中，控制电渗

12、流非常重要中，控制电渗流非常重要。 1.1.电场强度的影响电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时， 电渗流速度正比于工作电压。 2.2.毛细管材料的影响毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电 荷特性不同，产生的电渗流大 小不同； （1 1）溶液）溶液pHpH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密 度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7pH=7，达到最大，达到最大； pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析 时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。 （2 2）阴离子的影响）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，

13、毛细管中 的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。 缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工 作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电 渗流下降。 毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。 温度变化来自于温度变化来自于“焦耳热焦耳热”； 焦耳热焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCEHPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强 度成正比。度成正比。 温度每变化温度每变化1 1，将引起背景电解质溶液黏度变化，将

14、引起背景电解质溶液黏度变化2%2%3%3%； （1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大， 使溶液的黏度增大，电渗流减小。 （2）加入表面活性剂，可改变电 渗流的大小和方向； 加入不同阳离子表面活性剂 来控制电渗流。 加入阴离子表面活性剂，如 十二烷基硫酸钠（SDS），可以使 壁表面负电荷增加，zeta电势增 大，电渗流增大； （3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈， 使电渗流增大。 淌度淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；带电离子在单位电场下的迁移速度； 淌度不同是电泳分离的基础。淌度不同是电泳分离的基础。 1.1.绝对淌度绝对淌度( (absolute mobility)ab 无

15、限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移 速度，简称淌度。可在手册中查阅。 2.2.有效淌度有效淌度(effective mobility)ef 实际溶液中的淌度(实验中测定的)。 ef ef=a =ai ii i ai 溶质i 的解离度；i 溶质i 在解离状态下的绝对淌度 3.3.表观淌度表观淌度 ap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）： ap ap= =ap ap E E 1.1.迁移时间（保留时间）迁移时间（保留时间） HPCEHPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱 理论也适用。理论也适用。 V LL E LL

16、 t ap ef ap ef ap ef V外加电压；L毛细管总长度； 2.2.分离效率（塔板数）分离效率（塔板数） 在在HPCEHPCE中，仅存在纵向扩散，中，仅存在纵向扩散，2 2=2=2DtDt 2 2/1 54. 5; 22 Y t n D EL DL VL n R efapefap 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生 物大分子的依据。物大分子的依据。 影响分离度的主要因素；工作电压影响分离度的主要因素；工作电压V V；毛细管有效长度；毛细管有效长度 与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：与总长度比；有效淌度

17、差。分离度可按谱图直接由下式计算： 2 21apap 平平均均 12 12 )(2 WW tt R D D扩散系数；扩散系数；L Lef ef毛细管有效长； 毛细管有效长；L L毛细管全毛细管全 长度；长度；V V工作电压；工作电压；二者之差。二者之差。 0.5 0.177()RDV eo平均+ 1.1.纵向扩散的影响纵向扩散的影响 在在HPCEHPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：中，纵向扩散引起的峰展宽：2 2=2=2DtDt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可可 获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。获得更高的分离效率，大分

18、子生物试样分离的依据。 2.2.进样的影响进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分 离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度： Winj= (24D t )1/2 实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%1%2%2%。 电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：电泳过程产生的焦耳热可由下式计算： 2 2 Ec Lr IV Q bm m电解质溶液的摩尔电导；I工作电流：cm电解质浓度； 散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），散热过程中，在

19、毛细管内形成温度梯度（中心温度高）， 破坏了塞流，导致区带展宽。破坏了塞流，导致区带展宽。 改善方法：改善方法： （1 1）减小毛细管内径；）减小毛细管内径； （2 2）控制散热；）控制散热； 存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽； 蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题 特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题难题。 细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面 积大，又增加了溶质吸附的机会。 减小吸附的方法和途径减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质， 两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负 电中心作用，浓度约为溶质的10

20、0-1000倍时，抑制对蛋白质 吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。 （1 1）电分散作用对谱带展宽的影响）电分散作用对谱带展宽的影响 当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带 展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。 （2 2）“层流层流”现象对谱带展宽的影响现象对谱带展宽的影响 一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在 压力差时，出现抛物线形的层流； 产生的原因产生的原因：毛细管两端液面高度不同。 实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。 电压：电压：0 030kV30kV； 分离柱不涂敷任何固定液；分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测

21、器；紫外或激光诱导荧光检测器； （可检测到：（可检测到：1010-19 -19 1010-21 -21 mol/L mol/L） （1 1）0 030 30 kV kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直流电源； （2 2）具有恒压、恒流、恒功率输出；）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3 3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序控制系统； （4 4）电压稳定性：）电压稳定性：0.1%0.1%； （5 5）电源极性易转换）电源极性易转换； 2. 2. 毛细管柱毛细管柱 （1 1）材料：石英：各项）材料：石英：各项 性能好；玻璃：光学、机性能好；玻璃：光学、机 械性能差；械性能差； （2

22、 2）规格：内径）规格：内径2020 7575m m，外径，外径350350400400m m； 长度长度=1m 电泳 电泳时 时, ,阴离子在阴离子在 负极最后流出负极最后流出, ,在这种情况下在这种情况下, ,不但不但 可以按类分离可以按类分离, ,同种类离子由于同种类离子由于差差 速迁移速迁移被相互分离。被相互分离。 最基本、应用广的分离模式；最基本、应用广的分离模式； 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分 离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，

23、分离效率高。离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、蛋白质、DNADNA等的电荷等的电荷/ /质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，CZECZE模模 式很难分离，采用式很难分离，采用CGECGE能获得良好分离，能获得良好分离，DANDAN排序的重要手段。排序的重要手段。 特点特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘 度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。 1.1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界

24、缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界 浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。 在电场力的作在电场力的作 用下，胶束在柱中用下，胶束在柱中 移动。移动。 2. 2. 电泳流和电渗流的方向相反，且电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电渗流 电泳 电泳 ， ， 负电胶束以较慢的速度向负极移动；负电胶束以较慢的速度向负极移动； 5.5.色谱与电泳分离模式色谱与电泳分离模式 的结合。的结合。 3.3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强 的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；的组分与胶束结合的较牢，流

25、出时间长； 4.4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用 范围范围； 1. 1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术； 2. 2. 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围 的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6 68 8V V） 时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pHpH梯度；梯度； 3. 3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所

26、带电荷与溶液氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pHpH有关，在有关，在 酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中 性，淌度为零；性，淌度为零； 4. 4. 聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下 迁移，分别到达满足其等电点迁移，分别到达满足其等电点pHpH的位置时，呈电中性，停止的位置时，呈电中性，停止 移动，形成窄溶质带而相互分离；移动，形成窄溶质带而相互分离； 5. 5. 阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOHNaOH溶液；溶液； 6.

27、 6. 加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测； 7. 7. 电渗流在电渗流在CIEFCIEF中不利，应消除或减小。中不利，应消除或减小。 1. 1. 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子( (充满充满 毛细管毛细管) )和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间， 并以同一速度移动。并以同一速度移动。 2. 2. 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负 离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极

28、前进，逐离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐 渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。 3. 3. 不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同 ( (= =EE) )，淌度大的离子区带电场强度小；，淌度大的离子区带电场强度小； 沿出口到进口，将不同区带依次排序沿出口到进口，将不同区带依次排序1 1、2 2、3 3、4 4 电场强度依次增大。假设电场强度依次增大。假设“2”2”号中离子扩散到号中离子扩散到“3”3”号，该号，该 区电场强度大，离子被加速，返回到区电场强度大，离子被

29、加速，返回到“2”2”区；当区；当“2”2”号中号中 离子跑到离子跑到“1”1”号区，离子被减速使之归队；号区，离子被减速使之归队； 4. 4. 特点：界面明显，富集、浓缩作用；特点：界面明显，富集、浓缩作用； 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电 渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动 色谱过程；色谱过程； 阳离子分析阳离子分析 迁移方向和电渗流迁移方向和电渗流 方向一致；方向一致； 4.5min4.5min内分离了内分离了2424 种金属离子；种金属离子； 阳极进样

30、，阴极检测；阳极进样，阴极检测； 具有很高的灵敏度；具有很高的灵敏度； 阴离子电泳方向和电渗流阴离子电泳方向和电渗流 方向相反、速度接近，分析时方向相反、速度接近，分析时 间长、效率低；间长、效率低； 质量小、电荷密度大的离质量小、电荷密度大的离 子如：子如：SOSO4 4-2 -2、 、ClCl- -、F F- -等，电等，电 泳速率大于电渗流，阳极端流泳速率大于电渗流，阳极端流 出，在阴极端无法检测；出，在阴极端无法检测； 加入电渗流改性剂，十六加入电渗流改性剂，十六 烷基三甲基溴化胺等，使电泳烷基三甲基溴化胺等，使电泳 方向和电渗流方向一致，可在方向和电渗流方向一致，可在 3.1min3.1min内分离内分离3636种阴离子；种阴离子； 阴极进样，阳极检测；阴极进样，阳极检测； 离子价态及存在形态分析；离子价态及存在形态分析； 检测体液或细胞中检测体液或细胞中 某些代谢产物的分析；某些代谢产物的分析； 尿液中的氨基酸含尿液中的氨基酸含 量作为临床诊断糖尿病量作为临床诊断糖尿病