二醇柱高效液相色谱法测定人参提取液中的人参皂苷

1、第26卷第4期吉林化工学院学报Vol .26No .42009年8月JOURNAL OF J I L I N I N STIT UTE OF CHE M I CAL TECHNOLOGYAug .2009收稿日期:2009-07-16作者简介:董少鹏(1970-,男,吉林长春人,吉林省石油化工设计研究院高级工程师,主要从事石油化工方面的研究.3通讯作者:娄大伟(1973-,副教授,E -mail:l oujlict .edu .cn文章编号:100722853(20090420005203二醇柱高效液相色谱法测定人参提取液中的人参皂苷董少鹏1,娄大伟23,孙大志2,王悦虹2,任红2(1.吉林省

2、石油化工设计研究院工艺所,吉林长春130021;2.吉林化工学院化学与制药工程学院,吉林吉林132022摘要:采用二醇柱,在等度洗脱条件下,建立了高效液相色谱(HP LC 定量分析人参提取液中人参皂苷的检测方法.优化的色谱条件:L i Chr os pher 100D i ol 柱(250mm x 2mm i .d .,5m ,流动相为乙腈2水(体积比为8218,流速为1.0L m in -1,检测波长为200n m,柱温为15.研究结果表明:在较低温度下,采用二醇柱分析7种主要人参皂苷,具有分析速度快,不需要梯度洗脱程序,方法简单等优点.关键词:高效液相色谱柱;二醇柱;等度洗脱;人参皂苷中图

3、分类号:R 286.0文献标识码:A人参是我国名贵的药材,已有数千年的药用历史.目前,国内外对其主要的活性成分人参皂苷预防和抑制肿瘤的作用进行了深入研究.研究结果发现:人参总皂苷及各单体化合物对促进肿瘤细胞凋亡,促使肿瘤细胞分化,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,以及提高机体抗肿瘤的免疫力等方面有重要的作用.按照人参皂苷的结构类型、糖基的数量和位置将分离鉴定出的数十余种单体皂苷化合物分为3组:(a 20(S 一原人参二醇型,如人参皂苷Ra,Rb1,Rb2,Rb3,Rc,Rd,Rg3,Rh2,R s;(b 20(S 一原人参三醇型,如人参皂苷Re,Rf,Rg1,Rg2,Rh1;(c 齐墩果酸型,如

4、人参皂苷Ro .在所有这些人参皂苷中,7种主要成分(Rf,Rg1,Rd,Re,Rc,Rb2,和Rb1是含量最高的,也是主要的药理活性成分.一些分离方法包括:薄层色谱(T LC 1、气相色谱(GC 2和配有紫外检测器(UV 、蒸发光散射检测器的高效液相色谱或质谱检测3-6都已经被研究.在这些方法中,高效液相色谱已经广泛应用于人参皂苷的分析.由于它的灵敏度高,广泛应用于不挥发性化合物,而且其不需要有衍生化就能完成分析.高效液相色谱也更容易应用于上述的各种检测技术.在高效液相色谱法中,研究普遍采用了传统的C18柱,使用梯度洗脱,流动相采用乙腈与水的混合物或缓冲液.这些方法使人参皂苷成分分离受到限制,

5、而且分离时间很长,大部分分离时间需要60m in 左右.本文建立了一种新的人参皂苷分离方法,采用了固相萃取前处理技术对样品进行处理后,使用二醇柱进行等度洗脱分离.与传统的C18分离方法相比,该法具有分离速度快,分离度好,灵敏度高等优点,而且实现了样品中7种主要人参皂苷的同时测定.1实验部分1.1试剂与仪器人参皂苷标准对照品Rf,Rg1,Rd,Re,Rc,Rb2和Rb1购于法国Extrasynthese 公司,置于4冰箱中避光保存;用于液相色谱流动相或样品处理的乙腈和甲醇(色谱纯,购于天津市大茂化学试剂厂;所有实验用水均采用高纯水;人参样品购于kanebo 公司.岛津LC 20AT 高效液相色谱

6、仪(紫外2可见检测器;色谱柱:L i Chr os pher 100D i ol 柱(250mm 2mm i .d .,5m ;色谱工作站:浙大智达N2000系统(浙江大学智达信息工程有限公司;固相萃取小柱:C18(500mg/3mL,北京华尔博科技有限公司.1.2标准溶液的配制使用甲醇为溶剂配制成浓度为300ng/L的标准储备液.取适量的标准储备液逐级稀释后得到所需浓度的标准溶液.用于高效液相色谱定性分析时,配制成适宜浓度的单品溶液.所有样品均置于冰箱内保存.1.3样品处理方法准确量取人参提取液1mL于5mL样品瓶中,加入1mL水,超声处理10m in.取1mL处理液过C18固相萃取小柱(预

7、先用5mL甲醇和5mL 水活化.分别用5mL水和5mL30%的甲醇水溶液洗柱后,用3mL甲醇洗脱待分析物,洗脱液经0.2m PTFE滤膜过滤后,在室温条件下用氮气吹干.残留物用适宜量甲醇定容后,用于高效液相色谱测定.1.4色谱条件流动相:乙腈2水(体积比为8218,流速: 1.0L/m in;检测波长:200nm;柱温:15;柱温控制:将色谱柱置于含有常温水的保温水槽中,在不断搅拌条件下,向水槽中不断加入碎冰,待温度达到实验温度,停止加冰.温度稳定5m in后,进行液相色谱测定7.2结果与讨论2.1色谱分离条件的优化由参考文献得知,人参皂苷的最大吸收波长在203n m,实验选取了198205n

8、m,在其他条件相同条件下测试人参皂苷,得出在200n m时,人参皂苷有最大的响应值.实验在室温条件下进行流动相配比的优化,在乙腈与水的体积比为8218时,7种人参皂苷的分离效果最好.然而,人参皂苷Rf和Rg1,Rd 和Re仍未完全分离.因此,研究中主要考察了温度对分离条件的影响.实验选取0,5,10,15,20, 25为主要温度控制点,分别进行高效液相色谱分离测定.结果表明:在流动相组成乙腈与水的体积比为8218,温度为15时,所有的人参皂苷达到了最好的分离效果.在3个典型的温度下,人参皂苷标准品的色谱图如图1所示.因此,实验选取了检测波长200nm,流动相组成乙腈2水(体积比为8218,柱温

9、15为最佳色谱分离条件 .t/m int/m int/m in1.Rf;2.Rg1;3.Rd;4.Re;5.Rc;6.Rb2;7.Rb1图13个温度条件混合人参皂苷标准品的色谱图2.2实际样品分析采用本法对人参提取液实际样品进行了测定,并在最优化条件下对7种主要人参皂苷进行了定量分析.人参样品的色谱图如图2所示 .t/m in1.Rf;2.Rg1;3.Rd;4.Re;5.Rc;6.Rb2;7.Rb1图2人参样品的色谱图表1表明了其定量结果.6吉林化工学院学报2009年表1人参提取液中的人参皂苷含量人参皂苷皂苷含量3/mg (10mL -1样品人参提取液Rf 2.0090.0532.62Rg16

10、.4060.0610.95Rd 4.6140.0390.84Re M ean S DRS D /%6.3680.0180.28Rc 8.8370.0941.07Rb210.0680.0720.72Rb114.4150.0210.143n =3.3结论本文建立了用二醇柱同时分离7种主要活性人参皂苷的分离方法,该方法解决了传统C18柱分析时间长、分离效果差等缺点,而且无需梯度洗脱条件,在等度洗脱情况下17m in 之内即可完成.结果表明,该方法具有简单、快速,同时分离效果好等优点,可以用于人参皂苷的分离和检测.参考文献:1Vanhaelen -Fastre R.,FaesM.,Vanhaelen

11、M.H igh 2perf or mance thin -layer chr omat ographic deter m inati on of six maj or ginsenosides in Panax ginseng J .J.Chr omat ogr .A,2000,868:269-276.2Cui J.F .,B j?erkhem I .,Ener oth P .Gas chr omat o 2graphic -mass s pectr ometric deter m inati on of 20(S 2p r ot opanaxadi ol and 20(S 2p r ot o

12、panaxatri ol for study on hu man urinary excreti on of ginsenosides after in 2gesti on of ginseng p reparati ons J .J.Chr o mat ogr .B,1997,689:349-355.3L iW.,Gu C .,Zhang H.,et al .U se of high -perfor m 2ance liquid chr omat ography tande m mass s pectr ometry t o distinguish Panax ginseng C .A.M

13、eyer (A sian Gin 2seng and Panax quinquef olius L.(North American Ginseng J .Anal .Che m.,2000,72:5417-5422.4J i H.Y .,Lee H.W.,Ki m H.K .,et al .,Si m ultaneousdeter m inati on of ginsenoside Rb1and Rg1in hu man p las ma by liquid chr omat ography 2mass s pectr ometry J .J.Phar m.B i omed .Anal .,2

14、004,35:207-212.5Lou D.W.,Sait o Y .,J inno K .Solid -phase extracti onand high -perf or mance liquid chr omat ography f or si m 2ultaneous deter m inati on of i m portant bi oactive ginsen 2osides in phar maceutical p reparati ons J .Chr oma 2t ographia,2005,62:349-354.6Lou D.W.,Sait o,Y .,J inno K

15、.Si m ultaneous LC deter 2m inati on of ginsenosides using a modified extracti on p r ocedure and an i m p r oved step gradient p r ogra m J .Chr omat ographia,2006,63:31-37.7Lou D.W.,Sait o,Y .,Zarzycki P .K .,Oga wa M.,J in 2no K .Is ocratic separati on of ginsenosides by high -perf or mance liqui

16、d chr omat ography on a di ol colu mn at suba mbient te mperatures J .Anal .&B i oanal .Che m.,2006,385:31-37.D eterm i n a ti on of g i n senosi des i n g i n seng flu i dextract usi n g h i gh 2perfor mance li qu i d chro ma tography w ith d i ol colu mnDONG Shao 2peng 1,LOU Da 2wei 2,S UN Da 2zhi

17、 2,WANG Yue 2hong 2,REN Hong2(1.J ilin Petr ochem ical Design &Research I nstitute,Changchun 130021,China;2.College of Che m istry and Phar maceutical Engi 2neering,J ilin I nstitute of Che m ical Technol ogy,J ilin City 132022,China Abstract:A high 2perfor mance liquid chr omat ographic method was

18、devel oped f or deter m inati on of ginsenosidesin ginseng fluidextract using di ol colu mn with is ocratic eluti on .The op ti m izati on conditi ons were carried out on a L i Chr os pher 100di ol column (250mm 2mm i .d .,5m with acet onitrile and water (8218v/v as mo 2bile phase at a fl o w rate of 1.0mL /m in .The detecti on wavelength was 200nm ,and the colu mn te mperature was 15.The results