液相色谱法测定大隆的方法学研究

1、液相色谱法测定大隆的方法学研究大隆（敌鼠隆）是目前国际上认为毒力最强的抗凝血杀鼠剂，具有靶谱广、毒力高、使用浓度低、对第一代抗凝血杀鼠药产生抗性的鼠类有效的特点1，大面积灭鼠省工、省饵。大隆生产中如某个环节控制不严格，产品中就会出现中间体和杂质，影响其灭鼠效能。对杀鼠药进行质量检测，是灭鼠及鼠药生产中一个极其重要的环节。目前国内、国际无大隆标准检验方法2-3。文献4报道，高效液相色谱法测定大隆，样品前处理需经过萃取过滤减压蒸馏萃取过滤蒸干溶解等8个步骤。其缺点是操作繁琐，难掌握，费水、费电、费时、费试剂，大批样品测定需要技术人员也较多。笔者研究的以快速提取法处理样品，用HPLC定量的实验方法，

2、大大减少了财力、人力的消耗，提高了方法的准确度、灵敏度，加快了检验速度，每个样品可节约仪器设备、试剂、水、电等开支数百元，具有很好的经济效益和社会效益。此方法不仅可对大隆生产原料、原粉、母粉、母液、毒饵进行分析，还可监测其它香豆素类杀鼠药，故可应用于误食鼠药中毒样品的分析鉴定。 1实验部分1.1仪器与试剂1.1.1仪器Beckman 344M型高效液相色谱仪(165紫外检测器，427积分仪)、液体快速混合器(江西医疗器械厂)、粉碎机(江苏金坛金城镇华仪器厂)。1.1.2试剂优级纯丙酮、色谱纯甲醇(江苏淮阴塑料制品厂精细化工研究所)、优级纯醋酸、高纯水(经MILLI-Q处理，电导率 1.0s/c

3、m2)。1.1.3大隆标准储备溶液精确称取提纯后含量99%的大隆标准品0.1000g，于100ml容量瓶中，用少量丙酮完全溶解后，再用甲醇稀释至刻度，置冰箱4保存。该溶液浓度为1.0mg/ml。1.1.4大隆标准使用溶液取大隆标准储备溶液0.5ml，于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液浓度为50g/ml。1.2实验原理大隆杀鼠药中的有效成分经丙酮浸取、甲醇稀释后，用色谱柱分离，再以紫外检测器在最大吸收峰处测量吸收强度。其吸收强度与浓度关系符合朗伯比尔定律。1.3色谱条件色谱柱：AGEX ODS C18柱(5 4.6mm25cm)；流动相：甲醇10%醋酸(V/V)90+10；流速1.0m

4、l/min；检测器波长265nm；进样体积20l。1.4大隆样品前处理样品称重全部精确至0.0001g。1.4.1原粉称取大隆原粉样品0.020.03g，于25ml具塞比色管中，用丙酮完全溶解后稀释至刻度。取该溶液1.0ml于10ml比色管，用甲醇稀释至刻度。1.4.2母粉称取母粉样品0.10.3g，于50.0ml具塞比色管中，用移液管加入25ml丙酮，在液体快速混匀器上振荡510min，放置片刻，待液体稍清亮后，以0.5m FH滤膜过滤。1.4.3母液称大隆母液0.10.3g，于25.0ml具塞比色管中，加甲醇至刻度，混匀后以0.5m FH滤膜过滤。1.4.4毒饵样品经粉碎机粉碎后过4060

5、目分样筛。取过筛后样品25g，于25ml具塞比色管中，用移液管加入10ml丙酮，浸泡20min，将比色管置液体快速混合器上萃取10min，放置片刻，待液体稍清亮后以0.5m FH滤膜过滤。经上述处理后的样品，用HPLC以外标法定量分析。1.5结果计算用标准溶液的峰面积与样品的峰面积进行外标法定量。计算公式：式中 Cs为大隆标准溶液浓度(g/ml)；As为大隆标准溶液的峰面积；Aw为样品溶液的峰面积；W为样品的重量(g)；K为样品稀释倍数。2结果与讨论2.1样品中共存物的分离实验选择良好的色谱分离条件，将大隆与样品中的杂质完全分离，是大隆有效成分准确定量的关键。我们用甲醇与水、甲醇与不同浓度醋酸

6、、甲醇与1%(w/v)正磷酸的不同比例为流动相，分别以BECKMAN和AGEX色谱柱做分离条件实验。结果如下：2.1.1AGEX ODS C18柱(5，4.6mm25cm)在甲醇10%醋酸90+10时，大隆原粉、母粉、母液及干扰成分较多的毒饵样品中，有效成分及与其共存的杂质均可完全分离，不影响大隆的准确定量(14)。1大隆原粉色谱分离2大隆母粉色谱分离3大隆母液色谱分离4大隆毒饵色谱分离2.1.2BECKMAN ODS C18柱(5，4.6mm25cm C18柱)在甲醇10%醋酸75+25为流动相时，可得到大隆标准溶液异构体的两个峰(5)，且测定样品时异构体与样品中其它杂质也能完全分离。异构体

7、的比例与灭鼠效能、生物活性、代谢速度等有关5-6。但由于醋酸在流动相中所占的比例较大，为避免对色谱柱的损伤，实验前后柱子的冲洗比较麻烦，不是特殊需要不采用该条件。 5大隆异构体色谱分离2.24羟基香豆素类杀鼠药的同时分离在实验条件下，4羟基香豆素色谱峰的保留时间(RT)为1.64，杀鼠灵为2.66，杀鼠迷为3.46，溴敌隆为4.31，大隆为6.26，故该方法亦可应用于误食鼠药中毒样品的定性、定量分析。2.3样品前处理条件的选择实验2.3.1溶剂的选择大隆易溶于三氯甲烷、苯，中度溶解于丙酮，微溶于甲醇。前两种溶剂毒性较大，污染严重；我们以丙酮做为样品前处理溶剂，既可实现在色谱分离时所产生的溶剂峰

8、不干扰大隆的准确定量，又做到其溶解度能够满足实际样品分析的需要。2.3.2大隆母粉、毒饵浸取时间的选择液体快速混合器震动力量大，频率高，速度均匀，大隆含量为0.5%的母粉，称取0.4g加丙酮25ml；0.5/万的毒饵，称7.0g加丙酮10ml，在混合器上震动浸取510min，被测组份可完全浸出(表1)。表1母粉、毒饵浸取时间实验样品浸取时间(min)样品浸取时间(min)5101551015母粉0.490.490.50毒饵0.480.480.48(%)0.500.500.50(/万)0.510.500.510.500.490.502.4紫外检测器吸收波长的选择实验在上述色谱条件下，在对大隆标准

9、溶液分析的同时，用165型紫外检测器在200350nm范围内进行扫描，大隆紫外最大吸收波长为265nm。2.5线性范围和检测下限实验准确吸取一定量的大隆标准储备液于容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度为5.0、30.0、60.0、120.0、240.0、300.0g/ml的标准溶液系列，在上述色谱条件下以20l定量杯进样，做峰面积与浓度的标准曲线，线性回归方程Y=3.7194+10.1374x，相关系数：r=0.9999，方法的最小检测浓度0.3g/ml(按3倍信噪比计)，检测下限6.0ng。2.6精密度实验大隆原粉、母粉、母液、毒饵样品各1份，按上述样品前处理方法及测定条件做8次重复测定，相

10、对标准偏差(RSD)分别为0.59、3.45、1.02、4.11(表2)。 表2精密度实验(n8)样品精密度平均值SRSD(%)原粉81.60%4.8710-10.59母粉0.50%1.7310-23.45母液0.52%5.3410-31.02毒饵0.51/万2.1010-24.112.7方法的准确度实验取精密度实验后已知有效成分含量的原粉、母粉、母液、毒饵样品各15份于比色管中，分成3组，每组分别加入样品本底浓度0.5倍、1倍、2倍的大隆标准溶液，摇动比色管，使样品与标准溶液充分接触。除母液外，其它样品管置水浴中将溶剂完全挥发掉。将以上比色管按样品处理方法的步骤制成待测溶液，再按上述色谱条件

11、测定其回收率，每种样品各浓度组的平均回收率、标准差、相对标准偏差见表3。表3大隆样品回收率实验(n5)样品种类本底量(g/ml)加标量(g/ml)平均回收率(%)标准差(s)相对标准差(RDS%)原粉 50.025.099.341.61651.627250.050.099.721.56031.564750.0100.0100.070.80090.8003母粉 20.010.097.681.78241.824720.020.098.831.00321.015120.040.098.910.38980.3941母液 20.010.098.201.70731.738620.020.099.520.8

12、7150.875720.040.099.150.33180.3347毒饵 10.05.097.022.31292.384010.010.097.301.61011.654810.020.098.850.87140.8816综合上述，大隆杀鼠药用快速提取法处理样品、HPLC定量分析，具有简便、快速、准确度好、灵敏度高、节省经费的特点，适宜大批量样品测定。该方法不仅适用于各级卫生防病等部门的鼠药质量监测工作，还可为鼠药生产及用户提供保证鼠药质量的可靠数据。 作者单位：天津市卫生防病中心(邮编 300011)参考文献1张一宾,张怿.农药.北京:中国物资出版社,1998，534.2国家技术监督局标准化司编.中华人民共和国标准目录及信息总汇