免疫组化法实验操作步骤.doc

1、。免疫组化染色实验操作流程实验目的：观察标记物在细胞中的表达及分布。一、病例资料和实验分组标本：经 10% 福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4m厚切片编号备用。二、试剂及免疫组化方法2.1实验试剂：xx 两步法免疫组画试剂盒和DAB显色试剂盒进行组化染色。抗体 1, 抗体 2。二甲苯、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇、30% H2O2、羊血清、 Triton液、中性树脂等。2.2仪器(1)10 l 、 100l、 200l、 1000l 可调微量加样枪（ 2） 4冰箱(3) 光学显微镜(4) 恒温水浴锅(5) 恒温烤箱(6) 电热蒸馏水器(7)LEICA 显微镜及VISI

2、TRON照相系统(8) 其他：量筒、电炉、高压锅、染缸、湿盒、脱蜡架、冲洗球、免疫组化笔等。2.3 主要试剂的配置（ 1） 0.01M PBS(PH7.4) 缓冲液NaCl9.0 g磷酸氢二钠2.901 g磷酸二氢钠0.296 g加入 1000ml容量瓶，加 ddH2O至 1000ml 定容。充分混合（ 2） 0.01mol/L 柠檬酸盐溶液（ PH 6.0 ）A 液： 0.1M 柠檬酸溶液 (4 保存 )29.01g 柠檬酸1000ml ddH2OB 液： 0.1M 柠檬酸钠溶液(4 保存 )29.41g 柠檬酸钠1000ml ddH2O缓冲液现用现配（1000ml 0.01 mol/L）A

3、液（18ml）+B液(82ml)900ml dH2O充分混合，调整PH 6.0 ，充分混合，调整PH 6.0（ 3） 3% H2O230% H2O2：甲醇 =1： 9(4)0.1%Triton的配制Triton 原液0.1 ml0.01PBS 液99.9ml精选资料，欢迎下载。4保存备用。（ 5） 5%羊血清的配制（ 1ml）羊血清50 l0.1%Triton 950 l4保存。2.4免疫组化方法(1) 石蜡切片 60烤箱烤片 30min.(2) 石蜡切片常规脱蜡二甲苯 15min -二甲苯 15min -无水乙醇 15min -无水乙醇 5min -无水乙醇 5min - 95%乙醇 5mi

4、n - 90%乙醇 5min - 80%乙醇 5min - 70% 乙醇 5min -蒸馏水冲洗3min，浸泡待用（浸泡在什么溶液中？）。（ 3）抗原修复：切片浸入沸腾的盛0.01M 柠檬酸缓冲溶液（PH 6.0 ）的压力锅内盖上锅盖，加上压力阀，继续加热至喷气，开始计时2min 后，离开热源自来水冲洗至室温。取出切片，蒸馏水冲洗2 次，每次3min。（ 4） 0.01MPBS液冲洗 5min， 2 次(5) 甩去 PBS液，每张切片滴加 1 滴（ 50l ）3%H2O2 室温孵育 10min( 目的：阻断内源性过氧化物酶活性 )(6)PBS 冲洗 5min， 3 次(7) 甩去 PBS液，每

5、张切片滴加1 滴（ 50l）羊血清室温孵育10min。(8) 甩去血清。a: 每张切片滴加 1 滴 X 抗体（ 50l ）， 4过夜（约 18h）b:每张切片滴加1 滴 X 抗体（ 50l ），室温过夜（约20）( 根据不同抗体选择不同温度、时间过夜)(9) 室温下孵育 45min ， PBS液漂洗 5min ，3 次(10) 甩去 PBS液，每张切片滴加 1 滴（ 50l ）聚合物增强剂 （ A 剂），室温下孵育 20 min(11) PBS 冲洗 5min， 3 次(12) 甩去 PBS液，每张切片滴加 1 滴（ 50l ）聚合物增强剂 （ B 剂），室温下孵育 30 min (13)PBS 液漂洗 5min， 3 次（ 14）甩去 PBS液，每张片滴加 2 滴新配置的 DAB溶液，显微镜下 3-10min ，观察显色情况(15) 自来水冲洗(16) 梯度酒精脱水： 70%-80%-90%-100% -100%，每次 10min(17) 脱色：二甲苯 - 二甲苯，每