试验研究鲁氏耶尔森菌感染虹鳟鱼地进入路线及组织分布英译汉

1、百度文库让每个人平等地捉升口我实验研究鲁氏耶尔森菌感染虹鱒鱼的进入路线及组织分布扌商要：鲁氏耶尔森菌是红口石餉肠道疾病的病原体，它给全世界水产养殖鮭鱼 行业带来了重大的损失。尽管这种疾病有很大的重要性，但是有关该疾病的现有 可用的发病机制资料却很少。在这项研究中，采用不同4种鲁氏耶尔森氏菌株接 触感染虹鱒鱼的方法来进行研究感染入口。细菌学和组织学检查发现，鲁氏耶尔 森菌在内部器官迅速传播感染后，鲍中出现了大量细菌。但是，只有致病性株是 能够生存和繁殖在寄主上，导致感染败血症，并在数天之后死亡。这些结果表明, 鲍可能是一个重要的入口，而鲁氏耶尔森菌的致病性与免疫逃避有关。关键i司：鲁氏耶尔森菌

2、感染入口 致病性 虹鱒鱼引言鲁氏耶尔森菌病原体是耶尔森氏鼠疫杆菌肠道病或红口石缈肠道疾病（ERM） 的病原体，它给全球范围内的鮭鱼养殖造成了重大的损失。虽然感染这种病原体 的情况在其他鱼类中已经有所报导，鮭鱼（尤其是虹鱒）是最容易被ERM感染的 （Furones et al. 1993）。感染可能会导致在体表和内部器官出现大出血的慢性 或急性败血症。尽管ERM很重要，但人们对鲁氏耶尔森菌能够战胜宿主防御和引起疾病的确 切致病机制却知之其少。而鲁氏耶尔森菌株之间的不同的致病性已经有所研究记 录，主要是通过腹腔和肌肉注射以及接触曝光进行的。（Davies 1991, Romalde & Toran

3、zo 1993, Austin et al. 2003, Fouz et al. 2006）.但是，这后者的方法，似乎是一个更加可靠和有效的感染模型，它尽可能准 确地模仿自然感染的条件，并可确保位于体表面的免疫机制发挥他们的作用。然 而，它尚未确定何时以及虹鱒鱼如何被鲁氏耶尔森菌感染，以及细菌驻留在被感 染鱼的位置。这次研究的LI的是揭示鲁氏耶尔森菌感染虹鱒鱼的入口路线（实验1）,并探 讨在感染不同的4种鲁氏耶尔森菌后，不同的时间间隔（实验2）,它的组织分布 情况。进行了额外的实验感染(实验3a和3b),以确定是否有不同的组织分布 与致病性的差异。山于已知温度对虹鱒鱼免疫相关的功能有影响，在2

4、种不同温 度条件下，进行了鲁氏耶尔森菌的致病性研究。(Nikoskelainen et al. 2004, Ferndndez et al. 2007).1材料和方法细菌菌株：在实验中，我们用4种不同的鲁氏耶尔森菌株。菌株5最初是 于2001年在英国，从虹轉鱼的养殖中出现临床症状的ERM中分离出来的，后来 从水产养殖研究所获得(Stirling, Scotland) 菌株(2-1)和E842-95是L Institut National de la Recherch 6 Agronomique 提 供的仃NRA, Paris, France) 从虹鱒鱼中分离出的菌株(2-1)无临床症状。没有任

5、何背景资料关于 应变E842-95的可用。CCUG 14190菌株类型是从哥德堡大学(瑞典)的菌种保 藏中获得的，它是从带有ERM的虹鱒鱼中分离出来的。所有的菌株都属于血清型 01a除了鲁氏耶尔森菌E842-95,这是一个血清型01b菌株，是被J. L. Roma Ide 区分出来的(Universidad de Santiago de Compostela, Spain).。菌株储存的悬浮液被储存在-70 Co在解冻后，一夜之间，在20 C下， 用5%羊血(blood agar),细菌被种植哥伦比亚琼脂(Oxoid)上。菌落是从琼脂 平板取来的，在20 C下，在营养肉汤(NB,VWR)中培养

6、24小时。菌落形成单位 (CFU),每毫升的数量是由血液琼脂板上10倍稀释液决定的。动物：我们获得的30, 81, 83和120虹鱒鱼的这4个批次(实验1, 2, 3a and 3b),重达6至45克，22至55克，3至20克和8至60克，分别从没有ERH 疾病历史的养鱼场Grouville, Belgium)得到的。鱼被驯化10天，维持在1000 升罐，用循环自来水过滤。它们每天被饲喂商业饮食(Vijver Visvoeder). 为确保动物们容易感染鲁氏耶尔森菌，牺牲了 10%的每个新引进的批处理的鱒 鱼。来自鲍、肠、肝、肾、脾的样本都要做细菌化验。此外，每次实验开始询，样本分别取自2个随

7、机选择的鱼的皮肤，鳍和鲤，然后 对外部寄生虫进行微观评价。鲁氏耶尔森菌从任何样本的血琼脂培养基上分离出 来的，所有鱼类都没有外部寄生虫病。3百度文邮-让每个人平零地捉升口我实9佥感染：所有的感染试验都获得了根特大学兽医医学学院的伦理委员会 的批准（EC2005/73, EC 2007/094, EC 2008/026）。在 实验1,6鱼的这组是同浴挑战，无论是鲁氏耶尔森菌株5, （2-l）,CCUG 14190 还是E842-95 （总共4组），最后的浓度约2 X 108 CFU ml - 1.。经过1小 时曝气水族馆在18 C下的接触曝光后，鱼被再次转移到他们的坦克。在时间点 0,和h感染（

8、PI）,从每个感染组取出2条鱼，对其使用过量的苯佐卡因（1 g 乙基苯屮酸国家10毫升的丙酮）的办法，使之安乐的死掉。在安乐死了之后, 用湿腌法清洗鱼，消去皮肤和鲍上的非粘性的细菌。六控制鱼没有被感染，并保 持在同等条件下，从2取样，在每一个时间点，像被感染的鱼一样的方式。在实验2中，18鱒鱼接触到最后的浓度约2X107 CFU ml-1的鲁氏耶尔森 菌株1小时像在实验1中的方式一样。每个感染组的两条鱼的采样在1、2、 4、6、9、12、24、48和72 h PI。九个控制鱼保持像被感染的鱼的相同 条件下，从1中每一个时间点釆样保存。在 实验3a, 20鱼的4组都背接触暴露在23 C下1小时。

9、最后的浓度是2 至3 X 107CFUml 的4鲁氏耶尔森菌株。五个控制鱼与被感染的鱼相同条件 下保存。接种后，观察记录鱼的临床症状每天数次，还有死亡率。对死亡和垂死 的鱼进行验尸。剩下的鱼在14与18之间被感染安乐死。在实验3b, 25鱼的4组被接触暴露在16 C与实验1相同的方式1小时。 最后的浓度约10 CFU ml - 1 CFUml - 1的4鲁氏耶尔森菌株。第二十控制鱼想 被感染的鱼的相同条件下保存。像实验3d中，对死亡和垂死的鱼进行验尸，剩 下的鱼在14与18之间被感染安乐死。在所有实验中，鲍，近端和远端肠道，肝脏，肾脏和脾脏标本进行细菌，病 理和免疫组化检查。从实验1和2,取额

10、外的样品中肠，从实验1中的所有鱼 沿着左侧的侧线，背鳍下方取1平方厘米的皮肤组织。细菌学检;则：把收集的组织匀浆在作为悬浮液的10% （w/v）的磷酸盐缓冲 液中。通过把10倍的稀释的悬浮液培养在血液琼脂平板上，来确定鲁氏耶尔森 氏菌g-l肝脏，肾脏和脾脏的数量。把稀释的鲍，肠道和皮肤的悬浮液接种在 麦康凯琼脂板上（蛋白）。根据典型菌落形状和负面的氧化反应来确定华鲁氏耶 尔森氏菌。系统上，每个培养皿上分离的鲁氏耶尔森氏菌的一个可疑菌落的鉴定 也是用PCR方法确定（聚合酶链反应）。PCR分析：通过使用碱裂解法（巴埃莱等人2000）从环形细胞中提取DNA。 通过使用Koback等人的引物YER8的

11、鲁氏耶尔森氏菌在虹鱒鱼（5 -GCG AGG AGG AAG GGT TAA GTG-3）的进入路线和 YER10 （5 -GAA GGC ACC AAG GCA TCT CTG-3） 来执行PCR,如前文Gibello等人所述（1999）,其中YER10扩增了鲁氏耶尔森 氏菌的575个片段。对于每个PCR反应，制备的lu L DNA添加到9 u L的PCR 混合物中，含有u 1 1的、的HotmasterTaq聚合酶（Eppendorf公司）,10 倍的PCR缓冲液（Invitrogen生命技术公司），25 mM氯化镁（Invitrogen公 司），每个脱氧核昔三磷酸（Amersham Ph

12、armacia公司生物技术）为200 uL, 每个引物（正负）和无菌蒸谓水均为口仁用于扩增的条件如下：在94C下开始 5分钟变性，接下来是在94C下进行35周期的一分钟变性，在61C下退火一分 钟，在72C下扩展1分钟。最终在72C下扩展8分钟。PCR产物在含有的多 用途琼脂糖（勃林格）一倍的三硼酸-乙二胺四乙酸（简称TBE）缓冲液的琼脂 糖凝胶中产生的，该缓冲液pH值8,澳化乙锭染色。该凝胶显象使用摄影大师 VDS （Amersham Pharmacia 生物技术）。纟且织学及免疫纟且织化学分析：在实验1中，把组织样本放入卡诺解决方 案中（60%乙醇，30%氯仿，10%乙酸，）至少2小时，在

13、酒精二甲苯中脱水，石蜡 包埋。在脱水和嵌入石蜡前，把实验2, 3&和3b中的器官放入10%屮醛磷酸盐缓冲 至少24小时。安装在载玻片上的五-um的切片，用苏木精和曙红（H&E）和姬姆 萨染色。此外，用抗鲁氏耶尔森氏菌多隆兔抗体进行免疫。通过就如Decostere等人 （1999）描述的鲁氏菌株7免疫家兔（欧共体2005 /921）来获得高免血清。石蜡 包埋的五-Um切片的组织被放置在免疫组化玻片上（Sigma-Aldrich公司），进行 脱蜡，水化，山抗原检索微波技术预处理。此后，用内源性过氧化物酶在玻片上 培养，并用PBS冲洗一次。然后，连续对玻片进行一下操作：放入30%山羊血清， 用初级兔

14、抗鲁氏耶尔森菌7 1/800的抗体，生物素标记羊抗兔抗体1/500 （DakoCytomation）,辣根过氧化物酶（DakoCytomation）,最后每个步骤用3, 3 -二氨基联苯胺四盐酸盐冲洗一次（Sigma-Aldrich公司）。切使用水基苏木精染 色计数和安装。统计分析：在实验1和2中，固定效应模型是第一次（萨斯版9.1.3）被用 来比较鲁氏耶尔森氏菌g-1的CFU （菌落形成单位）的，菌株作为固定效应， 器官作为分层因素，那么时间和器官是固定效应和菌株是分层因素。分析是在全 球熬的显著水平下完成的。经报道的两两比较的P -值是用Tukey s多重比较 方法调整的在实验3a和3b中

15、，死亡时间结果的分析是基于用所给的相同的排名最高的 幸存鱼进行的秩和检验。首先，死亡时间结果与把是不同接触暴露组与每个实验 组之间进行比较的结果。其次，死亡时间结果是2之间为各菌株的2个实验间检 测的。由于正态分布的假设并不成立Wilcoxon符号秩检验是用来比较鲁氏耶 尔森氏菌落的CFU的g-lh和从只使用动物的鲁氏耶尔森氏菌中至少分离出一个 鱼的不同器官。结果实验1纟田菌检验：对于实验1,从勰（图1）中再次分离出细菌的最高数量。这些 数字均显着高于在菌株5（ p二）和（2 - 1） （p二）中从介于感染0到内的肠道再次 分离出的数量。对于鲁氏耶尔森氏菌株5, （2-1）和CCUG14190

16、,再次从腮、皮肤和 肠道中分离出的细菌数量在感染后0到间减少，在感染到间维持一样或是有稍 微的上升。检测到，在感染0,和后，从接种菌株的鱼的皮肤细中分离出的菌数 量比才肠的细菌数量多。然而，在这段时间内，只有从菌株5的皮肤中分离出的6百度文邮-让每个人平零地捉升口我细菌数量显着高于(p二)肠道。6.005.004.003.002.001.000.00(bnLLQY rucked 17.00(2-1)Tim ih)(bnLLQ 60_Time (h)10图1鲁氏耶尔你氏菌感染虹鲂。在感染0,和后，鲁氏耶尔淼氏菌在虹鱒鱼的鲍，肠(后肠中肠和前肠道 处)和皮朕接触菌株(a) 5, (b) (2-1)

17、, (c)CCUG14190和(d) E812-95的检测。每个时间点代表2只鱼。在 每个样木中的细菌的数虽:被表达为日志(CFU gl组织)对于鲁氏耶尔森氏菌E842-95,在感染0到内，在腮内的细菌数量逐渐减少。 在这段时间内，从肠道再次分离出的细菌数量也显示逐渐的减少趋势；然而，在 感染0到内，在皮肤内的细菌数量却轻微的增加，随后就观察到出现急剧减少。 在感染0到小时内，这些器官中的细菌数量之间的差异没有显著的统计学意义。 在感染鲁氏耶尔森氏菌株5, (2-1), CCGU14190,和E842-959 0到内(数据无显 示)波动后，立刻就在所有鱼的肝脏、脾脏和肾脏(介于101和105

18、CFU g-1) 就发现了细菌。组织学及免疫组织化学分析：在接触暴露鲁氏耶尔森氏菌株5, (2-1), CCGU 14190和E842-95的0,到内，与阴性对照组相比，在鱼的任何器官内 都没有观察到组织病理变化。姬姆萨染色和免疫组织化学染色显示了儿条接种菌 株5的鱼的鲤内存在鲁氏耶尔森氏菌。在未感染时间，在初级和次级层粘液观测 到大量的细菌，而后来，观测到细菌数量减少了。在感染后0到内，在次级层粘 液，在2条鱼的毛细血管显示出存在少量的细菌(图2&)。在接种鲁氏耶尔森氏菌 株3的鱒鱼肠道内，在不同的时间点，很少发现在隐窝，绒毛，附于粘膜内有细 菌存在（图2b）。在接种菌株（2 - 1）, C

19、CUG 14190WE842-95的鱼的肠道和鲍内，观测到鲁氏 耶尔森氏细菌数量明显降低（史上最低）。在鲤粘液和在隐窝和粘膜的肠段观察 到有细菌存在。鲁氏耶尔森氏菌无法探测用组织学或免疫组织化学感染的鱼的皮 肤，肝脏，肾脏和脾脏的。图2。鲁氏耶尔森氏菌感染虹蹲。（a）在感染0小时后（PI）在（a）鲍的毛细血管（姬姆萨染色）和（b） 绒毛和黏膜之间的肠腔（免疫组织化学染色）的位宜。实验2细菌检查：在实验2中，在感染的前2h内，从接触感染鲁氏耶尔森氏菌菌株5, （2-1）, CCUG 14190和E842-95（图3和图4）的鱒鱼鲍中再次分离出数量最多的 细菌。细菌数量经过一段时间的波动，在感染鲁

20、氏耶尔森氏菌5, （2-1）, CCUG 14190, E842-95分别在24, 48和12, 48h内，在鲍组织细菌数量不再增加。然而, 在接种鲁氏耶尔森氏菌株5的鱼的鲍中，在感染后的48h到72h内，细菌数量急剧 增加，而在其他感染组的鱼鲍中没有分离出细菌。在感染后的询12h内，再次从接种鲁氏耶尔森氏菌（2-1）和E842-95的鱼的肠 道内分离出的细菌数量较低。在感染后的24h到48h内，在这些鱼的肠道内分离出 的细菌数量有轻微的增加，在这段时间内，从肠道分离出的细菌数量超过了从腮 中分离出的细菌数量。通过比较，在感染后的前12h内，从接种鲁氏耶尔森氏菌 株5的鱼的肠道内分离出的细菌数

21、量较高，在感染后的48h到72h,细菌数量急剧增 加。对接种鲁氏耶尔森氏菌CCUG14190的鱼的肠道，在感染后的lh到72h内，儿乎 没有或是有很少数量的细菌被再次分离出的。在感染后的lh到72小时内，在接种感染鲁氏耶尔森氏菌株5的鱼的肝脏，肾 脏和脾脏中发现了细菌。感染后的6h在这3种组织中的细菌数量达到波动高峰（介 于X诃 和 X 104 CPU g-1之间）,并注意到在感染后的48h到72h内，细菌 数量急剧增加。通过对比，在分别接种鲁氏耶尔森氏菌（2-1）和CCUG14190感染 后的前9h到24h鱼的肝脏、肾脏和脾脏内，细菌的数量较低（W X 101 CFU g - 1）。此后，在

22、这些器官中不再发现有细菌的存在。在接种鲁氏耶尔森氏菌E842-95 的鱼的肝脏、肾脏和脾脏中也观测到了相似的趋势，然而，在感染后的lh到24h, 从这些组织中再次分离出的细菌数量稍微较高。在接种鲁氏耶尔森氏菌（2-1）的鱼鲍中细菌数量显著高于在肠道（p二）、肝 脏（p）、肾脏（卩二、脾脏（p中的细菌数量。对于接种鲁氏耶尔森氏菌CCUG 14190 的鱼鲍中细菌数量显著高于在肠道（p二）、肝脏（p二）、肾脏3二、脾脏（p二中的细 菌数量。从接种鲁氏耶尔森氏菌株5的鱼的肾脏中再次分离出的细菌数量显著高 于从接种鲁氏耶尔森氏菌（2-1） （p=） ,E842-959p=和CCUG 14190 （p=

23、）的鱼肾 脏再次分离出的数量。用鲁氏耶尔森氏菌株3感染的鱼的脾脏和肾脏中的细菌数 量也显著高于用鲁氏耶尔森氏菌（2-1）（分别pm）和CCUG14190 （分别pm）感 染的鱼的脾脏和肾脏中的细菌数量。在感染后的72h,接触-暴露于鲁氏耶尔森氏 菌5的鱼的肝脏、肾脏和脾脏中的细菌数量显著高于用其他菌株感染的在这些器 官中的细菌数量。百度文邮-让每个人平零地捉升口我1224372Timei(h)Tb ndo) ?1 246912244872Timo (h)图3鲁氏耶尔森氏菌感染虹虬 在感染1,2,4,6,9,12,24,48和72h后，鲁氏耶尔森氏菌在虹鮒鱼的勢 肠道(后肠，中肠和前肠道处)接触

24、菌株(a) 5, (b) (2-1), (c)CCUG14190和(dE842-95的检测。每个时间 点代表2只鱼。在每个样木中的细菌的数虽被表达为日志(CFU gl组织)(b5lo4.54.02.=52.01.51.0gY.55.004.504.003.505.002.502.001.501.000.50Y. ruckh 17.8(2 -1)-耐sp=4nQOO0.00图1鲁氏耶尔森氏菌感染虹虬 在感染1,2,4,6,9,12,24,48和72h后，鲁氏耶尔森氏菌在虹鮒鱼的肝脏.肾 脏和脾脏接触菌株(a) 5, (b) (2-1), (c)CCUG14190和(d) E842T5的检测。每个

25、时间点代表2只鱼。在每 个样木中的细菌的数址被表达为日总(CFU g-1组织)组织学及免疫组织化学分析:在接触感染鲁氏耶尔森氏菌菌株3, (2-1),CCUG14190和E842-95感染后的lh到72h内，与阴性对照组相比，在鱼的任何组织 中没有观察到组织病理变化。用组织学和免疫组织化学分析没有检测到细菌。实验3a和3b临床症状，死亡率和尸检结果。在实验3d和3b中的对照组的鱼没有注意到有 疾病症状或是死亡率。在这两组实验中，只在接种鲁氏耶尔森氏菌5 （表1）的虹 鱒鱼中观测到了临床症和死亡率。在实验3d中，在感染后的5h到llh内，接种鲁 氏耶尔森氏菌5的20条鱼中的6条死亡了，在感染后的

26、7d,死亡率达到最高值。他 们没有显示其他临床症状。存活下来的鱼也没有显示临床症状或是病变。在实验 3b中，在感染后的9d平均为内，接种鲁氏耶尔森氏菌5的25条鱼中的4条死亡了， 这些鱼眼球突出伴有眼眶出血，其中一条的肝脏肿和脾脏出现了肿大。表1鲁氏耶尔葆氏菌感染虹期。采用浸泡方法，用鲁氏耶尔森氏菌5感染虹鳄鱼的结果临床和細菌学检査。 只有死鱼的器官被包括在内。PI：感染后Expt/ StrainMoan timo of death Id Pl)No. of Y. ruckoii log10 CFU g1 tissuo (moan 土 SB) isolatedTotalWith clhiico

27、l signsThat diedGillsProximal gutDEtdlLivergutSpleenKichieyExpt 3a520067 25.5 1.18.6 2.17.5 1.17.0 058.2 1.27.2 0.5Expt 3b32524788.0 237.4 2.57 4 2.47.8t 1 97.8 1.97.8 t.9在这两个浸泡实验中，与其他菌株相比，菌株5显示了较高的死亡率（p）. 在其他菌株的死亡时间上，这两组实验没有显著差异。纟田菌检查：在实验3a和3b中，没有从对照组鱼的器官中分离出鲁氏耶尔森 氏菌。在实验3a中，没有从6条死鱼的鲍、近端和远端肠、肝脏、肾脏、脾

28、脏中 再次分离出鲁氏耶尔森氏菌，这6条鱼接触感染鲁氏耶尔森氏菌5的范围是IO：到 103CFU g-1 （表1）。在接触范围是10到10 CFU g-1的鲁氏耶尔森氏菌5组织后 存活的鱼中，从4条鱼中的一个或是多个器官中再次分离出细菌，这种情况在肾 脏中观测到的次数最多。在实验3b中，没有从4条死鱼的鲍、近端和远端肠、肝 脏、肾脏、脾脏中再次分离出鲁氏耶尔森氏菌，这4条鱼接触感染鲁氏耶尔森氏 菌5的范围是10倒10sCFU g-1 （表1）。在接触曝光后的21d对它施以安乐死的存 活鱼1中，分别从脾脏和肾脏中再次分离出了鲁氏耶尔森氏菌5的g-1组织的X 10:和 X 10的 CFUo在那些施以

29、安乐死的鱒鱼中，在它们接种了鲁氏耶尔森氏菌菌株（2 - 1）, CCUG 14190或E842-95的器官中，从未表明有细菌的存在。在接种鲁氏耶尔森氏 菌5的动物中，在鲁氏耶尔森氏菌g-l的CFU鲍、近端和远端肠、肝脏、肾脏、脾 脏中没有观察到有差异。组织学及免疫组织化学分析：山于只有鲁氏耶尔森氏菌在鱼的体内引 起了疾病和死亡，釆用组织学和免疫组织化学来分析用该菌株感染鱼的样本组 织。一些死亡的鱼组织标本容易验尸衰变，因此难以解释。该结果不包括过于恶 化的样本。为了分析组织病理变化，把受感染的鱼样品与阴性对照组鱼进行对比。观测到实验3和3b的结果是相似的。感染后死掉的儿乎所有的鱼在次级层都 岀

30、现中度至严重水肿，而生存下来的鱒鱼的鲍表现出较低或无水肿。在有大量病 灶细菌的许多动物尸体的脾脏中观测到了要合并的凝固性坏死多焦（图5&）。只 有1条接触鲁氏耶尔森氏菌5后存活下来的鱼的脾脏显示非常轻度局灶性坏死。在 那些接种鲁氏耶尔森氏菌5的存活下来的鱼的肾脏中，观察到有变性或肾小管轻 度坏死（图5b）。这些结果很少出现在死鱼的肾脏中。肾小球簇的细胞增加出现 在接种暴露鲁氏耶尔森氏菌5后死亡或存活下来的少量动物的中。在肾脏中，感 染后大部分幸存鱼的巨噬细胞的数量略有增加。少数感染后死亡鱒鱼在巨噬细胞 的数量上也略有增加。经菌株5感染后，死亡或存活的鱼有一半左右在黑色素巨 噬细胞（图5c）的数

31、量急剧增加。在肠道或肝脏无病理变化。13百度文库让每个人平等地捉升口我图5。鲁氏耶尔淼氏菌对虹时的感染。H&E (a)凝固性坏死脾的染色，(b)肾脏及肾小管.(c)菌株5在 接触暴露死亡三天后如蹲鱼肾脏中黑色素巨噬细胞显著増加免疫组化显示在所有能分离岀鲁氏耶尔森氏菌的所有器官中都有细菌存在。 在脾,细菌主要在坏死区及其周围被发现。在其他器官中细菌在细胞内随机分布。 然而，在肝脏中细菌还存在于胞浆内。PCR分析。在所有的实验中经PCR扩增验证鲁氏耶尔森氏菌，通过菌落形态确 定出分离物为鲁氏耶尔森氏菌。讨论细菌病原体想要感染宿主细胞，进入和附着到宿主的身体是笫一要求。采用 组织学和免疫组化技术调查

32、细菌和其宿主早期之间的相互作用，重要的是要保持 最佳的组织形态。卡诺的固定液被用来保持表面黏液凝胶层覆盖在不同的内脏器 官的表面粘液细胞。山于在感染早期 鲁氏耶尔森氏菌在粘液的粘附可能是重要 的，所以在实验1中使用了卡诺固定液来使组织标本固定。感染后很快就在鲍粘液中发现鲁氏耶尔森氏菌的粘附，随着时间的推移，黏 液中能检测到的细菌数量越来越少。感染后，在0到小时内在毛细血管中同样发 现了鲁氏耶尔森氏菌。这表明，细菌首先粘附在鲍粘液中，随后侵入鲍血管并 定植在内脏器官，导致败血症。Torroba (1993)等人的研究表明在虹鱒鱼腮与死 细胞的培养基中的体外实验中山鲤上皮细胞中分离出屮醛灭活鲁氏耶

33、尔森氏菌。 apata (1987)等人的从免疫浴后的大西洋鮭鱼的鲤细胞中提取出死的鲁氏耶尔 森氏菌细菌。然而，从死菌中获得的结果却不同于活菌。通过离体虹鱒鱼头模型 (McIntosh et al. 2000)表明鲍上皮吸收活的鲁氏耶尔森氏菌 细菌。U前体内 研究的结果表明，鲍确实可能是定植的重要门户。通过呼吸，鲤中有大量的毛细 血管，因此，它们可能会使细菌传播到鱼的整个身体变的更加容易(Ling et al. 2001)0虽然鲍是鲁氏耶尔森氏菌感染进入的重要门户，但细菌也能成功的定植在身 体其他表面，并通过各种路线进入机体，包括皮肤和肠道，如Busch & Lingg (1975) and

34、Valtonen et al. (1992)的研究结果表明。在我们的研究中，鲁氏耶尔森 氏菌的中等数量从皮肤和肠道感染后立即分离得到的。在组织检查中，有一些细 菌在肠道隐窝中被发现，说明了它们是在宿主的肠道黏膜中躲避宿主细胞的第一 次免疫攻击。还需要做进一步研究以确定屁股和肠道在细菌定植中的作用。感染导致鲁氏耶尔森氏菌迅速蔓延到内部器官。其它鱼类病原体像迟钝爱德 华氏菌和弧菌等在暴露接触一小时后同样也被从其他器官中再分离出来 (Spanggaard et al. 2000, Ling et al. 2001)。在目前的研究(实验2)中发 现菌株5在感染三小时后从内脏器官中再分离岀的鲁氏耶尔森氏

35、菌 数U急剧增 长。只有这株从感染后5天 起开始出现死亡率，这些器官中的细菌数量较高(实 验3&和3b)。相反，其他菌株在此时没有或只有少数细菌而且对感染鱼的内部器 官进行检测并没有发现临床症状和死亡率。在接触暴露于迟钝爱徳华氏菌后蓝曼 龙鱼的比较结果出现了。直到三天后感染鱼出现死亡率，感染的菌株内所有被观 察到的组织和器官中细菌数量开始呈指数式增长。非毒株浸泡后并没有出现死亡 率，然而，七天后所有组织内细菌数量都开始下降(Ling et al. 2001) 我们的 研究结果中毒力存在差异表明免疫系统能够清除鱼器官内非致命鲁氏耶尔森氏 菌细菌。也可能是山于免疫细胞对毒力菌株的攻击使器官内细菌细

36、胞数量临时 下降。鲁氏耶尔森氏菌在细胞或血液的残存和扩散使细胞数量增加，从而引起严 重的败血症和死亡。因此，研究巨噬细胞的相互作用，以及不同的鲁氏耶尔森氏 菌菌株的血清免疫也变得尤为重要。不同的因素可能会影响细菌感染的结果，包括温度。研究发现 鲁氏耶尔森 氏菌在水温为15到18 C时会对细菌感染产生明显的影响(Roberts 1983)。 Dan ley等人(1999)发现对注入腹腔 鲁氏耶尔森氏菌的鲍鱼斑点义尾的发病率 在18 C时远高于22 C时的发病率。感染的严重程度的增加可能是山于在较低 温度下 不同的鲁氏耶尔森氏菌virulence致病因素的上调，就如Ferndndez et(200

37、7)已经证明的那样。然而，最近的研究却发现在16和23 C下将鱒鱼暴 露于 鲁氏耶尔森氏菌并没有产生明显不同的临床症状。根据细菌学和组织学分 析，可能还有其他因素参与了影响，如感染剂量和鱼的大小。研究中受感染的鱼肾脏黑色素巨噬细胞的增加在我们先前的研究中也未曾被 描述过。在黑色素巨噬细胞中心，巨噬细胞已被证明会破坏和杀死真菌白色念珠 菌，同时硏究也发现它同样也在乔噬附近的虹鱒鱼红细胞(Passantino等。2002 年)。因此，黑色素巨噬细胞中心在消除外来的颗粒物质和鱼红细胞摄入的微生 物方面，似乎发挥了重要作用。黑色素巨噬细胞被认为是一种慢性炎症反应 (Ferguson 2006)的突出特

38、点。因此，我们的研究结果可能表明了鲁氏耶尔森氏 菌在慢性肾炎中可能发挥的作用。总之，鲍应该是鲁氏耶尔森氏菌感染虹鱒鱼时的一个重要进入部位。细菌可 能首先附着在鲤粘液，感染后他们很快侵入鲍血管，随后蔓延到内部器官。毒株 可能能够战胜宿主的免疫机制，导致含菌量高和器官坏死，并在感染后数天致使 鱼类死亡。暴露非毒株，却可以看到内部器官的细菌被彻底清除的结果。这就表 明免疫逃避是Y. Rucker的主要致病手段。致谢感谢J. L. Roma Ide为我们提供菌株血清,同时感谢D. Ameye, C. Puttevils, SLoomans, M. Foubert和V. Flama的技术支持。本次研究在

39、比利时根特大学 的研究基金的支持下完成，审批号：01110505o参考文献 Austin DA, Robertson PAW. Austin B (2003) Recovery of a new biogroup of Yersinia ruckeri from diseased rainbow trout (Oncorhynchus mykiss. Walbaum). Syst Appl Microbiol 26:127-131 Baele M, Baele P, Vaneechoutte M、Storms V and others (2000) Application of tRNA in

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